Circulerend tumor-DNA

Pre-analytische beschouwingenedit

wanneer bloed in EDTA-buisjes wordt verzameld en opgeslagen, beginnen de witte bloedcellen genomisch wildtype-DNA in het monster te Lysen en vrij te geven in hoeveelheden die doorgaans vele malen hoger zijn dan de ctDNA. Dit maakt opsporing van veranderingen of andere ctDNA biomarkers moeilijker. Het gebruik van in de handel verkrijgbare celstabilisatiebuizen kan de lysis van witte cellen voorkomen of vertragen, waardoor het verdunningseffect van de ctDNA wordt verminderd. Sherwood et al demonstreerden superieure detectie van kras mutaties in overeenkomende monsters verzameld in zowel EDTA K3 en Streck BCT buizen. De voordelen van celstabilisatiebuizen kunnen worden gerealiseerd in situaties waarin bloed niet onmiddellijk tot plasma kan worden verwerkt.

andere procedures kunnen ook de hoeveelheid “contaminerend” wildtype DNA verminderen en de detectie van ctDNA haalbaarder maken:

• Nooit bevriezen van een bloedmonster voor het uitpakken van het plasma ctDNA analyse
• Verwerken van het monster plasma binnen 2-4 uur (verzameld in EDTA-buis)
• gebruik Nooit heparinised buizen, heparine remt de PCR door het nabootsen van de helix-structuur van DNA
• het Uitvoeren van een dubbele centrifugatie stap (centrifuge het bloed te verwijderen plasma, dan herhaal aan het plasma te verwijderen van puin in de bodem van de buis) voor meer verwijderen celresten voor DNA extractie.
• Plasma is beter dan serum voor ctDNA recovery

extractie van ctDNAEdit

het belangrijkste bezwaar van ctDNA-analyse is dat het op een niet-invasieve manier wordt geëxtraheerd door middel van bloedinzameling. Acquisitie van cfDNA of ctDNA vereist meestal verzameling van ongeveer 3 ml bloed in EDTA-gecoate buizen. Het gebruik van EDTA is belangrijk om de bloedstolling te verminderen. De plasma-en serumfracties van bloed kunnen worden gescheiden door middel van een centrifugatiestap. ctDNA of cfDNA kunnen later uit deze fracties worden gehaald. Hoewel serum neigt om grotere niveaus van cfDNA te hebben, wordt dit hoofdzakelijk toegeschreven aan DNA van lymfocyten. De hoge niveaus van het besmetten van cfDNA zijn suboptimaal omdat dit de gevoeligheid van ctDNA opsporing kan verminderen. Daarom wordt in de meeste studies gebruik gemaakt van plasma voor ctDNA-isolatie. Plasma wordt vervolgens opnieuw verwerkt door centrifugeren om resterende intacte bloedcellen te verwijderen. De supernatant wordt gebruikt voor DNA-extractie, die kan worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare kits.

analyse van ctDNAEdit

de analyse van ctDNA na extractie vereist het gebruik van verschillende amplificatie-en sequentiemethoden. Deze methodes kunnen in twee hoofdgroepen worden gescheiden gebaseerd op de vraag of het doel is om alle genen in een untargeted benadering te ondervragen, of als het doel is om specifieke genen en veranderingen in een gerichte benadering te controleren.

niet-doelgerichte benadering

een geheel genoom of geheel exoomsequencingbenaderingen kunnen nodig zijn om nieuwe mutaties in tumorDNA te ontdekken, terwijl de ziektelast wordt gecontroleerd of geneesmiddelenresistentie wordt gevolgd. Untargeted benaderingen zijn ook nuttig in onderzoek om tumor heterogeniteit waar te nemen of om nieuwe drugdoelstellingen te ontdekken. Hoewel niet-gerichte methoden in bepaalde toepassingen nodig kunnen zijn, is het duurder en heeft een lagere resolutie. Dit maakt het moeilijk om zeldzame veranderingen te ontdekken, of in situaties waar lage ctDNA niveaus aanwezig zijn (zoals minimale residuele ziekte). Voorts kunnen er problemen zijn die tussen DNA van tumorcellen en DNA van normale cellen onderscheiden gebruikend een gehele genoombenadering.

gehele genoom-of exoomsequencing maakt doorgaans gebruik van DNA-sequencingtechnologieën met hoge doorvoer. Het beperken van het rangschikken aan slechts het gehele exome in plaats daarvan kan kosten verminderen en snelheid verhogen, maar ten koste van het verliezen van informatie over veranderingen in de niet-codeert regelgevende gebieden van DNA. Terwijl eenvoudig het kijken naar de polymorfismen van DNA door het rangschikken geen DNA van tumor of normale cellen onderscheidt, kan dit probleem worden opgelost door tegen een controlesteekproef van normaal DNA te vergelijken (bijvoorbeeld, DNA verkregen door een buccal swab.) Belangrijk, zijn het gehele genoom en het gehele exome rangschikken nuttig voor aanvankelijke mutatieontdekking. Dit levert informatie op voor het gebruik van gevoeliger gerichte technieken, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor de monitoring van ziekten.

het gehele genoom rangschikken maakt het mogelijk om de structurele eigenschappen van cfDNA, de grootte van fragmenten en hun fragmentatiepatronen terug te krijgen. Deze unieke patronen kunnen een belangrijke bron van informatie zijn om de opsporing van ctDNA te verbeteren of het weefsel van oorsprong van deze fragmenten te lokaliseren. Grootte-selectie van korte fragmenten (<150bp) met in vitro-of in silico-methoden kan het herstel van mutaties en afwijkingen van het aantal kopieën verbeteren.Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld door het laboratorium van Bert Vogelstein, Luis Diaz en Victor Velculescu aan de Johns Hopkins University. In tegenstelling tot het normale karyotyping waar een kleurstof wordt gebruikt om chromosomale banden te bevlekken om de chromosomen te visualiseren, gebruikt het digitale karyotyping de opeenvolgingen van DNA van loci door het genoom om de variatie van het exemplaaraantal te berekenen. De variaties van het exemplaaraantal zijn gemeenschappelijk in kanker en beschrijven situaties waar het verlies van heterozygositeit van een gen tot verminderde functie toe te schrijven aan lagere uitdrukking, of verdubbeling van een gen kan leiden, die tot overexpressie leidt.

Personalized analysis of rearranged ends (PARE)Edit

nadat het hele genoom is gesequenced met behulp van een high throughput sequencing methode, zoals Illumina HiSeq, wordt PARE toegepast op de gegevens om chromosomale herschikkingen en translocaties te analyseren. Deze techniek werd oorspronkelijk ontworpen om vast tumorDNA te analyseren maar werd gewijzigd voor ctDNA-toepassingen.Een goede epigenetische markering is essentieel voor normale genexpressie en celfunctie en afwijkende veranderingen in epigenetische patronen zijn een kenmerk van kanker. Een normale epigenetische status wordt gehandhaafd in een cel minstens gedeeltelijk door methylation van DNA. Het meten van afwijkende methylatiepatronen in ctDNA is mogelijk toe te schrijven aan stabiele methylatie van gebieden van DNA als “CpG eilanden”wordt bedoeld. Methylation van ctDNA kan door bisulfietbehandeling worden ontdekt. De bisulfietbehandeling zet chemisch unmethylated cytosines in uracil om terwijl het verlaten geméthyleerde cytosines ongewijzigd. DNA wordt later gerangschikt, en om het even welke wijzigingen aan het methylatiepatroon van DNA kunnen worden geà dentificeerd. Hydroxymethylation van DNA is een gelijkaardig geassocieerd teken dat om een voorspellende teller van gezonde versus zieke voorwaarden in cfDNA, met inbegrip van kanker is getoond te zijn. Het meten van afwijkende hydroxymethylatiepatronen in ctDNA is bewezen door onderzoekers aan de Universiteit van Chicago (Chuan He lab,) Stanford University (Quake lab,) en het bedrijf Cambridge Epigenetix.

gerichte benaderingedit

bij een gerichte benadering kan de sequencing van ctDNA worden gericht op een genetisch panel dat is samengesteld op basis van mutatie-hotspots voor de kanker van belang. Dit is vooral belangrijk voor het informeren van de behandeling in situaties waarin mutaties worden geïdentificeerd in druggable targets. Het personaliseren van gerichte analyse van ctDNA aan elke patiënt is ook mogelijk door vloeibare biopten met standaard primaire weefselbiopten te combineren. Het gehele genoom of het gehele exome rangschikken van de primaire tumorbiopsie staat voor ontdekking van genetische veranderingen toe specifiek aan de tumor van een patiënt, en kan voor het verdere gerichte rangschikken van ctDNA van de patiënt worden gebruikt. De hoogste gevoeligheid van ctDNA-opsporing wordt bereikt door het gerichte rangschikken van specifieke enige nucleotidepolymorfismen (SNPs). Algemeen gemuteerde genen, zoals oncogenen, die typisch hotspotveranderingen hebben, zijn goede kandidaten voor gerichte het rangschikken benaderingen. Omgekeerd, hebben de meeste genen van het tumorontstoringsapparaat een brede waaier van mogelijk verlies van functieveranderingen door het gen, en als zodanig niet geschikt voor het gerichte rangschikken.

gerichte benaderingen hebben het voordeel dat ctDNA wordt versterkt door middel van polymerasekettingreacties (PCR) of digitale PCR. Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van ctDNA niet alleen omdat er relatief lage niveaus van DNA circuleren in de bloedbaan, maar ook omdat ctDNA maakt een klein deel van de totale cel-vrije DNA geëxtraheerd. Daarom kan de versterking van gebieden van belang de gevoeligheid van ctDNA-opsporing drastisch verbeteren. Nochtans, kan de versterking door PCR fouten introduceren gegeven het inherente foutenpercentage van de polymerases van DNA. Fouten die tijdens het rangschikken worden geà ntroduceerd, kunnen de gevoeligheid van het ontdekken van ctDNA-mutaties ook verminderen.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

deze methode is afgeleid van de digitale PCR, oorspronkelijk genoemd door Bert Vogelstein ‘ s groep aan de Johns Hopkins University. Druppel digitale PCR gebruikt een druppelgenerator om enkele stukken van DNA in druppels te verdelen gebruikend een olie / wateremulsie. Dan treden individuele polymerasekettingreacties op in elke druppel met behulp van geselecteerde primers tegen regio ‘ s van ctDNA en gaan tot eindpunt. De aanwezigheid van de opeenvolgingen van belang wordt gemeten door fluorescente sondes, die aan het versterkte gebied binden. ddPCR staat voor hoogst kwantitatieve beoordeling van allel en mutantfrequenties in ctDNA toe maar wordt beperkt door het aantal fluorescente sondes die in één analyse (tot 5) kunnen worden gebruikt. De gevoeligheid van de analyse kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid geanalyseerd DNA en is rond 1 in 10.000.

Beads, emulsificatie, amplificatie en Magnetics (BEAMing)Edit

deze techniek bouwt voort op digitale PCR-druppels om mutaties in ctDNA te identificeren met behulp van flowcytometrie. Nadat ctDNA uit bloed wordt gehaald, wordt PCR uitgevoerd met inleidingen die worden ontworpen om de gebieden van belang te richten. Deze primers bevatten ook specifieke DNA-sequenties, of markeringen. Het versterkte DNA wordt gemengd met met streptavidin gecoate magnetische parels en geëmulgeerd tot druppeltjes. Biotinylated die inleidingen worden ontworpen om aan de markeringen te binden worden gebruikt om DNA te vergroten. Biotinylatie staat het versterkte DNA toe om aan de magnetische parels te binden, die met streptavidin met een laag worden bedekt. Nadat PCR volledig is, worden de DNA-gebonden parels gescheiden gebruikend een magneet. DNA op de parels wordt dan gedenatureerd en toegestaan om met fluorescente oligonucleotides specifiek voor elk malplaatje van DNA te kruisen. De resulterende parel-de complexen van DNA worden dan geanalyseerd gebruikend cytometry stroom. Deze techniek kan allel en mutatiefrequenties vastleggen toe te schrijven aan koppeling met ddPCR. Nochtans, in tegenstelling tot met ddPCR, kan een groter aantal opeenvolgingen van DNA wegens de flexibiliteit van het gebruiken van fluorescently verbindende sondes worden ondervraagd. Een ander voordeel van dit systeem is dat het geà soleerde DNA ook voor het stroomafwaarts rangschikken kan worden gebruikt. Gevoeligheid is 1,6 in 104 tot 4,3 in 105.

CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)Edit

deze methode werd oorspronkelijk beschreven door Ash Alizadeh en Maximilian Diehn ‘ s groepen aan de Stanford University. Deze techniek gebruikt biotinylated oligonucleotide selector sondes aan doelopeenvolgingen van DNA relevant voor ctDNA-opsporing. Publiek beschikbare kankergegevensbanken werden gebruikt om een bibliotheek van sondes tegen terugkerende veranderingen in kanker te construeren door hun terugkeerindex te berekenen. Het protocol werd geoptimaliseerd voor de lage DNA-niveaus waargenomen in ctDNA-collectie. Dan ondergaat het geà soleerde DNA het diepe rangschikken voor verhoogde gevoeligheid. Deze techniek staat voor de ondervraging van honderden gebieden van DNA toe. De ctDNA-opsporingsgevoeligheid van CAPP-Seq wordt gemeld om 2.5 molecules in 1.000.000 te zijn.

Tagged AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)Edit

TAM-Seq maakt gerichte sequencing van volledige genen mogelijk om mutaties in ctDNA te detecteren. Eerst wordt een algemene versterkingsstap uitgevoerd gebruikend inleidingen die het volledige gen van belang in 150-200bp secties overspannen. Dan, wordt een microfluidics-systeem gebruikt aan bevestigde adapters met een uniek identificatiemiddel aan elk amplicon om DNA in parallelle singleplexreacties verder te versterken. Deze techniek werd getoond om met succes veranderingen te identificeren die in het gen van het TP53 tumorontstoringsapparaat in geavanceerde ovariale kankerpatiënten worden verspreid. De gevoeligheid van deze techniek is 1 op 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq)Edit

deze methode werd oorspronkelijk beschreven door Bert Vogelstein en zijn groep aan de Johns Hopkins University. Safe-Seq vermindert het foutenpercentage van het massaal parallelle rangschikken om de gevoeligheid voor zeldzame mutanten te verhogen. Het bereikt dit door toevoeging van een unieke identifier (UID) opeenvolging aan elk malplaatje van DNA. DNA wordt dan vergroot gebruikend toegevoegde UIDs en gerangschikt. Alle DNA-moleculen met dezelfde UID (een UID-familie) zouden dezelfde gerapporteerde DNA-sequentie moeten hebben omdat ze uit één molecuul werden versterkt. Nochtans, kunnen de veranderingen door versterking worden geà ntroduceerd, of de onjuiste basistoewijzingen kunnen in het rangschikken en analysestappen worden geroepen. De aanwezigheid van UID staat deze methodologische fouten toe om van echte veranderingen van ctDNA worden gescheiden. Een mutatie wordt beschouwd als een’ supermutant ‘ als 95% van de sequenced reads in overeenstemming zijn. De gevoeligheid van deze aanpak is 9 op 1 miljoen.

duplex sequencedit

deze methode is een verbetering ten opzichte van de enkelvoudige UID ‘ s die in de Safe-Seq-techniek zijn toegevoegd. In het duplex rangschikken, handelt de gerandomiseerde dubbelstrengs DNA als unieke markeringen en aan een invariante afstandshouder in bijlage. Tags zijn bevestigd aan beide uiteinden van een DNA – fragment (α-En β-tags), wat resulteert in twee unieke templates voor PCR-een streng met een α-tag op het 5′ – uiteinde en een β-tag op het 3′ – uiteinde en de andere streng met een β-tag op het 5′ – uiteinde en een α-tag op het 3’ – uiteinde. Deze fragmenten van DNA worden dan vergroot met inleidingen tegen de invariante opeenvolgingen van de markeringen. Het versterkte DNA wordt gesequenced en geanalyseerd. DNA met de duplexadapters wordt vergeleken en de veranderingen worden slechts goedgekeurd als er een consensus tussen beide bundels is. Deze methode houdt rekening met zowel fouten van het rangschikken als fouten van vroege stadium PCR versterking. De gevoeligheid van de aanpak om mutanten te ontdekken is 1 op 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES verbetert de CAPP-Seq-analyse van ctDNA om fouten te verminderen en daardoor de detectiegevoeligheid te verhogen. Gerapporteerd in 2016, combineert iDES CAPP-Seq met duplex barcoding rangschikkende technologie en met een computationeel algoritme dat stereotiepe fouten geassocieerd met de CAPP-Seq kruising stap verwijdert. De methode integreert ook het Duplex rangschikken waar mogelijk, en omvat methodes voor efficiëntere duplexterugwinning van celvrije DNA. De gevoeligheid van deze verbeterde versie van CAPP-Seq is 4 in 100.000 exemplaren.