chromosoom 20 deleties bij myeloïde maligniteiten: reductie van het vaak verwijderde gebied, generatie van een PAC/BAC contig en identificatie van kandidaat-genen

Chromosoombanding en painting

chromosoompreparaten in het beenmerg van 107 gevallen met myeloïde aandoeningen werden geanalyseerd door G banding om de omvang van de deletie van de lange arm van chromosoom 20. Zoals eerder beschreven (Nacheva et al., 1995b), werden twee categorieën van 20Q verwijdering geïdentificeerd – grote schrappingen (59 gevallen), resulterend in verlies van beide Giemsa donkere banden van 20q (figuur 1a, boven), en kleine schrappingen (48 gevallen) waarin een Giemsa donkere band blijft (figuur 1a, onder). Vervolgens richtten we ons op de laatste groep patiënten (samengevat in Tabel 1).

VIS-analyse met behulp van een chromosoom 20 verf werd uitgevoerd op de 48 monsters met een kleine 20q verwijderen. In zes gevallen werd de’ 20Q-schrapping ‘ onthuld als gevolg van cryptische herschikkingen. In één geval identificeerde de gelijktijdige toepassing van verven voor chromosomen 15 en 20 een marker afgeleid van chromosoom 15 maar twee normale chromosomen 20-homologen (figuur 1b). In de overige vijf gevallen toonde chromosoomschildering de aanwezigheid aan van een onevenwichtige translocatie met een terugkerend breekpunt bij 20q11.2 en variabele chromosoompartners (figuur 1c). In alle vijf gevallen was de Der (20) marker het enige translocatieproduct dat in het genoom werd bewaard. Verder toonde FISH mapping aan dat het breekpunt op chromosoom 20 was opgetreden in een gebied proximaal aan d20s107 en bevestigde verlies van de rest van de lange arm van chromosoom 20 (gegevens niet getoond). Deze resultaten zullen elders in detail worden gerapporteerd.

in de overige 42 gevallen was chromosoomverf consistent met een kleine interstitiële deletie van 20q (figuur 1d). De meerderheid (33 gevallen) droeg een 20Q deletie als enige karyotypische afwijking. In de overige negen gevallen ging de 20Q-deletie gepaard met verschillende extra chromosomale afwijkingen (Tabel 1). Alle 42 gevallen met een kleine 20Q verwijdering werden onderworpen aan verdere vis mapping met locus specifieke sondes.

deletie mapping analyse

de 42 patiënten met kleine 20Q deleties werden geanalyseerd door FISH met behulp van een centromere PAC (CEP20), een PAC hybridisatie tot een distale regio van 20q (LSI 20q13) en een PAC hybridisatie binnen de CDR (LSI D20S108). Bij elke patiënt werden signalen van zowel LSI 20q13 als CEP20 maar niet LSI D20S108 waargenomen op het verwijderde chromosoom 20, wat de aanwezigheid van een interstitiële deletie bevestigt (samengevat in Figuur 3). Metafasen van elke patiënt werden vervolgens gehybridiseerd met PACs mapping op de grenzen van de bekende MPD en MDS / AML CDRs-D20S107 die ligt op de proximale grens van de CDRs en D20S176 die ligt telomeer van de distale grens van de CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

bij 37 patiënten (25 met MDS of AML, 12 met MPD) slaagden beide sondes er niet in om een signaal op het verwijderde chromosoom 20 te produceren dat de aanwezigheid van uitgebreide verwijderingen aantoont die de CDR ‘ s niet zouden helpen verfijnen. Dergelijke monsters werden niet verder onderzocht. Nochtans, in vier patiënten met MDS (DB53, MH40, DB122 en DB214) en één met MPD (JH41) gaf één van de twee sondes een signaal op het geschrapte chromosoom 20 en deze steekproeven werden in meer detail geanalyseerd.

naast de 42 patiënten met kleine 20Q deleties die werden geanalyseerd door FISH met locusspecifieke probes, werden nog eens zes patiënten met een 20Q deletie (vier met MDS, twee met MPD), van wie beenmergmetafasen niet beschikbaar waren, geanalyseerd met behulp van microsatelliet PCR. DNA van gezuiverde granulocyten en T-cellen werd geanalyseerd met behulp van een groot panel van polymorfe markers die de MPD en MDS/AML CDR ‘ s overspannen (Tabel 2). Alle vier MDS patiënten hadden verwijderingen die verder gingen dan de grenzen van de gepubliceerde CDR. Echter, bij een van de twee MPD patiënten (RB42), de centromere grens van de deletie aanzienlijk verminderd MPD CDR (Figuur 2, Tabel 2).

reductie van de common deleted region bij MDS / AML patiënten

voorlopige FISH analyse identificeerde vier MDS patiënten met deleties die inbreuk maakten op de MDS/AML CDR. In elk geval was de 20Q-deletie aanwezig in alle onderzochte metafasen. In drie gevallen (DB53, DB214 en MH40), was de 20Q-schrapping aanwezig als enige afwijking. Bij patiënt DB122 was de 20Q deletie de oorspronkelijke enige afwijking met twee subklonen die trisomie 21 of trisomie 8 en trisomie 21 bevatten naast de 20Q deletie die ook aanwezig was. Deze vier gevallen werden bestudeerd gebruikend extra locus specifieke sondes om de deletiegrenzen vast te stellen.

de proximale grens van de MDS / AML CDR werd verfijnd door patiënten DB53, MH40 en DB122. De proximale grens van de verwijdering in DB53 lag tussen D20S107 en WI-11538( Figuur 3), een afstand van ongeveer 400 kb. Voor patiënt MH40 gaf een PAC met WI-11538 (dJ357E14) consequent aanleiding tot een verminderd signaal dat consistent was met de aanwezigheid van het proximale deletie-breekpunt binnen deze PAC (Figuur 3). Bovendien lag de proximale grens van de deletie bij patiënt DB122 tussen sts-R52161 en stSG25449( figuur 1e, f), een afstand van minder dan 200 kb (figuren 3 en 4). Dit vertegenwoordigt een grote verfijning van de proximale grens van de MDS/AML CDR.

patiënt DB214 stond een aanzienlijke verfijning van de distale grens van de MDS/AML CDR toe. De distale grens van deze schrapping lag tussen WI-12515 en stSG40369( figuur 1g, h), een afstand van minder dan 100 kb (figuren 3 en 4).Deze gegevens reduceren de MDS / AML CDR dus aanzienlijk tot een gebied tussen PAC dJ620E11, dat sts-R52161 bevat, en PAC dJ196H17, dat WI-12515 bevat (figuren 3 en 4). De bacteriële kloon contig die hieronder wordt gepresenteerd toont de fysieke grootte van dit gebied aan om ongeveer 2,6 Mb te zijn.

reductie van het vaak verwijderde gebied bij MPD-patiënten

bij patiënt JH41 (diagnose PV) was de proximale grens van de deletie eerder bepaald door microsatelliet PCR tussen D20S438 en D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, dat D20S107 bevat (Figuur 4), gaf consequent aanleiding tot een verminderd signaal dat consistent was met de aanwezigheid van het proximale deletie-breekpunt binnen deze PAC (Figuur 3).

granulocyten en T-cellen van twee andere patiënten werden onderzocht met behulp van microsatelliet PCR (Tabel 2). Eén patiënt met PV (RB42) vertoonde retentie van heterozygositeit bij D20S108 maar verlies bij D20S858 (Figuur 2, Tabel 2). Het proximale breekpunt van de deletie bij deze patiënt lag tussen D20S108 en D20S858, een afstand van minder dan 200 kb (figuren 3 en 4).

deze gegevens verminderen sterk de MPD CDR die nu wordt geflankeerd door D20S108 (deze studie) en D20S481 (Wang et al., 1998). De geschatte fysieke grootte van dit gebied is 2.7 Mb, met behulp van gegevens van de bacteriële kloon contig hieronder weergegeven. Het gebied van overlapping tussen de nieuwe MDS/AML en MPD CDR ’s definieerde een gecombineerde “myeloïde” CDR van 1,7 Mb (Figuur 3).

een bacteriële kloon contig verspreid over de MPD en MDS / AML gemeenschappelijke verwijderde gebieden

we hadden eerder een 11 Mb YAC contig geconstrueerd van dit gebied van chromosoom 20 (Bench et al., 1998a). Om een meer gedetailleerde fysieke kaart te produceren, hebben we nu een aaneengesloten PAC en BAC gebaseerde kaart geconstrueerd. PAC en BAC klonen werden geïdentificeerd door hybridisatie van STSs aan genomische bibliotheken (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Klonen werden overlapt met behulp van restrictie fingerprinting (Gregory et al., 1997) en STS content mapping waardoor klonen kunnen worden gegroepeerd in contigs. Om contigs te overbruggen, werden nieuwe stss en de sondes van DNA, die van de einden van contigs worden ontwikkeld, gebruikt voor verder bibliotheekonderzoek. Nieuwe PACs en BACs werden vervolgens samengevoegd tot contigs op dezelfde manier totdat een aaneengesloten kaart werd geproduceerd.

de bacteriële kloon contig bevat in totaal 456 bacteriële klonen, waarvan 376 PACs en 80 BACs. Het strekt zich uit van D20S607 tot SEMG1 en omvat 202 tellers van DNA waarvan 185 STSs zijn en 17 sondes van DNA zijn. De grootte van de contig was gebaseerd op een gemiddelde van 3,5 kb per HindIII vingerafdrukband (P Deloukas (2000), ongepubliceerde resultaten). De geschatte grootte van de contig werd berekend als 5 Mb door het totale aantal verschillende vingerafdrukbanden binnen de contig te vermenigvuldigen met 3,5. In Figuur 4 wordt een afbeelding getoond van de kaart waarop het minimale tegelpad en het PACs worden weergegeven die bij de proeven met vissen werden gebruikt. Een volledige versie van de kaart is te vinden op http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map.

Identificatie van uitgedrukte sequenties

43 unieke ESTs werden gevonden tussen D20S607 en stSG34035 inclusief. Hiervan werden 34 ESTs in kaart gebracht door hybridisatie tot een ‘polygrid’ van PACs en BACs of door kolonie PCR van bacteriële kolonies die PACs of BACs bevatten (Figuur 4). Een extra negen ESTs, eerder in kaart gebracht in dit gebied van chromosoom 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) werden geplaatst op de contig door ontploffing uitlijning van Est sequentie met de beschikbare PAC of BAC genomic sequentie.

om veronderstelde sequenties van nieuwe expressie te identificeren, werden 23 PAC-klonen van het minimale tegelpad gedeeltelijk of volledig gesequenced. De genomische sequentie van deze klonen werd geanalyseerd met behulp van het NIX-programma (Williams et al., 1998) die de gelijktijdige observatie van een aantal hulpmiddelen van genidentificatie toestaat met inbegrip van Graal, GENSCAN en BLAST. Acht voorheen niet in kaart gebrachte ESTs en genen werden geïdentificeerd (Tabel 3). Zes daarvan lagen binnen de MPD CDR en zeven lagen binnen de MDS CDR. Het bewijs werd verkregen dat zes van deze acht veronderstelde uitgedrukte opeenvolgingen bonafide getranscribeerde genen vertegenwoordigden, eerder dan verwerkte pseudogenes of genomic contaminanten van DNA binnen het est-gegevensbestand. KCNS1 is een gen dat codeert voor een kalium spanningsgesloten kanaalsubeenheid. ESTs AA053206 / AA053121 werden vervolgens gevonden te worden afgeleid van het sgk2 gen (Kobayashi et al., 1999). Uitlijning van cDNA-sequentie naar genomische sequentie toonde een exon/intron-structuur aan voor drie van de resterende zes ESTs (AI312497, AA568401 en AA910031) met de splice site consensussequentie aanwezig bij alle exon/intron-grenzen. In alle drie deze gevallen werd de aanwezigheid van elke exon bevestigd door exon voorspellingsprogramma ‘ s zoals Graal. Het bestaan van een exon werd ook voorspeld door Graal, GENSCAN en Genefinder in het gebied van PAC dJ1108D11 die uitgelijnd op est AA993161 wat impliceert dat deze EST ook een getranscribeerd gen vertegenwoordigde.

Sequentieanalyse van PACs vanuit het minimale tegelpad liet ons ook toe om de genomische structuur van bekende en nieuwe genen in dit gebied vast te stellen. Uitlijning van rptprho cDNA naar PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 en dJ269M15 bleek dat dit gen minstens 1,2 Mb overspant. PAC dJ138B7 bevatte twee genen (h-l (3)mbt en SGK2) evenals het 5′-gedeelte van het gen dat overeenkomt met SHGC-36858. In het bijzonder bevat het gen H-l(3)mbt 20 exonen met twee vermeende alternatieve uiteindelijke exonen. De analyse van dJ644L1 toonde aan dat het menselijke gen MafB uit één enkel exon bestaat. Analyse van de voltooide sequentie werd ook uitgevoerd door het sanger centrum (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) en dit kan worden bekeken bij http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.

deze gegevens stellen de aanwezigheid vast van zes genen en nog eens 14 unqiue ESTs binnen de nieuwe MDS/AML CDR en een totaal van 14 genen met 23 unieke ESTs binnen de nieuwe MPD CDR (Tabel 3). Zes genen en 10 unieke ESTs zijn aanwezig in het gebied van overlapping tussen de twee CDRs.

Expressieprofilering

De myeloproliferatieve stoornissen, myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie zouden het gevolg zijn van transformatie van een multipotente cel binnen het hematopoëtische stamcelcompartiment (Bonnet en Dick, 1997; Kralovics en Prchal, 1998). Bovendien is eerder aangetoond dat de 20Q-schrapping zich kan voordoen in een vooroudercel die kan leiden tot zowel myeloïde cellen als B-cellen (White et al., 1994). Deze overwegingen suggereren dat het gen of de genen op chromosoom 20q die bij deze ziekten geïnactiveerd worden, waarschijnlijk tot expressie komen in normale hematopoëtische voorlopercellen. We bepaalden daarom welke van de getranscribeerde sequenties werden uitgedrukt in beenmerg en gezuiverd CD34 positieve cellen.

Reverse transcriptie PCR (RT–PCR) amplificatie werd uitgevoerd met primers die elk van de 51 getranscribeerde sequentie vertegenwoordigen (Figuur 5). Ten minste twee onafhankelijke RT–PCR versterkingen werden uitgevoerd voor elke getranscribeerde sequentie. Primers die overeenkomen met een EST (WI-7685) afgeleid van de 3′ UTR van het CD34-gen werden gebruikt als positieve controle (Figuur 5). Wanneer twee of meer ESTs overeenkwamen met dezelfde getranscribeerde volgorde, werd hetzelfde resultaat verkregen voor elke EST.

de gegevens zijn weergegeven in Figuur 5, tabellen 3 en 4. Van de 37 tot expressie gebrachte sequenties in de MPD CDR, 20 werden uitgedrukt in beenmerg mononucleaire cellen. Hiervan werden er 16 ook uitgedrukt in CD34-positieve cellen. Binnen MDS / AML CDR, werden 11 van 20 getranscribeerde opeenvolgingen uitgedrukt in beendermerg mononucleaire cellen. Hiervan werden er acht ook uitgedrukt in CD34-positieve cellen. Van de 16 getranscribeerde opeenvolgingen die binnen het gebied van overlapping tussen MPD en MDS/AML CDRs liggen, werden acht uitgedrukt in beendermergcellen waarvan vijf ook in CD34 positieve cellen werden uitgedrukt. Deze vijf getranscribeerde opeenvolgingen vertegenwoordigen daarom primaire kandidaatgenen aangezien zij binnen zowel MPD als MDS / AML CDRs liggen en binnen het hematopoëtische voorlopercelcompartiment worden uitgedrukt. Zij omvatten twee onbekende genen die aan ESTs SHGC-36858 en WI-12515 evenals drie genen, SFRS6, H-l(3)mbt en MYBL2 corresponderen.