Chimerism testen wordt gebruikt voor routine-documentatie van engraftment en post-transplantatie follow-up van allogene transplantatie ontvangers. Donor en ontvanger cellen kunnen worden onderscheiden door het testen van genetische markers die voorafgaand aan de transplantatie worden bepaald.2 bij geslachtsverschillen waarbij de ontvanger en de donor van verschillend geslacht zijn, wordt het aandeel van vrouwelijke en mannelijke cellen meestal bepaald door analyse van geslachtschromosoommarkers, meestal met vissen.8,9 beoordeling van variabele aantal tandem herhalingen (VNTR) of korte tandem herhalingen (STR) door PCR is uitgegroeid tot de meest waardevolle methode voor de bepaling van chimerisme in geslacht-matched transplantaties.10 verschillende methoden zijn ontwikkeld voor de detectie van MRD. Morfologische analyse van het merg kan residuele ziekte identificeren die meer dan 5% van de beenmergruimte inneemt en mist dus de nodige gevoeligheid voor vroege detectie. Ook, is het vaak moeilijk om een kleine bevolking van de leukemie blast van normale donor-afgeleide hematopoietic blasts te onderscheiden repopulating het merg zonder extra tellers te gebruiken. De specifieke tests kunnen MRD ontdekken wanneer er een specifieke tumormarker zoals een specifieke cytogenetic abnormaliteit, een specifiek immunophenotype is dat door FACS, specifieke opeenvolgingen van DNA of RNA kan worden geà dentificeerd die door PCR of een specifiek de groeipatroon in clonogenic analyses kunnen worden vergroot. Bij afwezigheid van een specifieke tumormarker voor MRD, kan het chimerisme testen worden gebruikt om ontvanger-afgeleide cellen te ontdekken. De detectie van cellen afkomstig van de ontvanger kan niet altijd correleren met het risico op recidief. De ontvangende cellen die tot gemengd chimerisme (MC) bijdragen behoren tot de kwaadaardige kloon of kunnen normale hematopoietic cellen, of zelfs stromale cellen zijn. Gedurende de eerste weken na standaard allogene transplantatie kunnen nog steeds ontvangende cellen worden gedetecteerd wanneer gevoelige tests worden gebruikt.Dit zijn meestal T-cellen die het conditioneringsregime overleven. Gastheercellen kunnen zelfs later na de transplantatie bij lage concentraties (<1%) worden gedetecteerd. MC wordt vaker gedetecteerd na niet-myeloablatieve conditionering.2 Zo, tumor-specifieke markers sondes zijn waarschijnlijk superieur en nauwkeuriger dan Geslacht-mismatch sondes voor detectie van MRD.12 echter, zelfs de detectie van MRD met tumor-specifieke tests kan niet altijd worden gecorreleerd met het risico van recidief. Positieve PCR-tests voor BCR / ABL zijn gemeld bij gezonde personen.De T (14;18) translocatie werd gedetecteerd in andere geslachten dan B-lymfocyten bij patiënten met non-Hodgkinlymfoom.Er kan een drempel zijn voor een klinisch significante MRD. Bij verschillende ziekten, zoals AML met t (8;21), 15 langdurige remissies zijn waargenomen in de aanwezigheid van MRD gedetecteerd door PCR, terwijl in andere, zoals bij acute promyelocytaire leukemie, PCR positiviteit recidief voorspelt.16 opnieuw, kan dit met de gevoeligheid van de specifieke PCR-test en de drempel aan klinische significantie worden gerelateerd. Resterende kwaadaardige cellen kunnen op een slapende status17 ontbreekt het potentieel om bij te dragen aan terugval, als gevolg van gebrek of winst van een tweede genetische wijziging. In sommige ziekten kan de gedeeltelijke differentiatie aan Rijpere cellen voorkomen en deze cellen kunnen het potentieel missen om zich te verspreiden. MRD kan onder immune toezicht zijn, of de MRD-cellen zijn in een apoptotische fase waardoor ze irrelevant zijn voor de herhaling van de ziekte. De gevoelige PCR-tests behouden geen cellulaire morfologie, en daarom is het onduidelijk welke cellen met MRD in deze verschillende het plaatsen correleren.
het Duet™ – systeem voor gecombineerde simultane morfologische en cytogenetische multiparametrische analyse biedt enkele voordelen die kunnen helpen bij het onthullen van de relevantie van MRD-detectie. Dit systeem zoekt automatisch een groot aantal cellen (ongeveer 150000 cellen per dia) naar kleine cellulaire subsets met een uniek cytogenetisch of immuun fenotype. De gevoeligheid voor detectie van kleine populaties wordt verhoogd. In een reeks verdunningsexperimenten hebben we aangetoond dat de gevoeligheid voor detectie van een mannelijke cel in een vrouwelijke celpopulatie hoger is dan 1:50000, maar vanwege de beperkte specificiteit in deze titer vindt de beste detectie plaats tussen 1:10000 en 1:50000 (zie bijlage). Zoals blijkt uit de analyse van beenmergmonsters van patiënt 1 (laatste analyse) en patiënt 2, kon Duet™ – systeem zeer kleine populaties XY-recipiente cellen detecteren die niet werden gedetecteerd door routine FISH. De kwantitatieve nauwkeurigheid van vissen is afhankelijk van de waargenomen frequentie en het aantal gescoorde cellen, dus verbeterd door meer cellen te scoren.18 het scoren van zo ‘ n groot aantal cellen is niet praktisch met handmatige vissen, maar het Duet™ automatische systeem kan 10000 cellen/min in de helderveldmicroscopie en 2000-10000 cellen/h in de fluorescentiemicroscopie scannen, waardoor de behoefte aan snel en efficiënt scannen en verhoogde gevoeligheid wordt ondersteund.
gevoelige tests worden vaak geassocieerd met een verminderde specificiteit en een relatief hoog foutpositief percentage. Bij standaardvissen kunnen vals-positieve scores optreden als gevolg van niet-specifieke hybridisatie van de sonde. Vals-positieve scores voor chromosomale translocaties kunnen optreden als gevolg van willekeurige ruimtelijke associatie en optische fusie.Het Duet™ – systeem kan de specificiteit mogelijk verbeteren door de morfologie van de cellen in de gezochte populatie te identificeren. Detectie van VISPOSITIVITEIT, in een kleine populatie, maar met een uniform Duet™ morfologisch uiterlijk, maakt het meer kans om een echte positieve, dan wanneer positieve cellen worden verspreid binnen verschillende, niet-verwante lijnen. De specificiteit van detectie van MRD met niet-specifieke chimerisme testen kan ook worden verbeterd. Zoals hierboven besproken, kunnen de ontvangende cellen tot de kwaadaardige kloon behoren (zoals bij patiënt 1), kunnen normale hematopoëtische cellen (patiënt 3, patiënt 1 na behandeling met STI571) of niet-hematopoëtische/stromale cellen (zoals osteoblasten, patiënt 2) zijn. Het Duet™ systeem maakt onderscheid tussen deze opties door het morfologische uiterlijk. We hebben aangetoond in de analyse van patiënt 1, en twee extra patiënten (gegevens niet getoond), dat identificatie van de ontvanger kenmerken (zoals tegenovergestelde geslacht cytogenetica) binnen blasten of onvolgroeide cellen voorspelt openlijke terugval en vooraf gaat met een paar weken tot een paar maanden. In patiënt 1 onthulden afzonderlijke VISANALYSES een kleine XY-ontvangende populatie (0,6%) en een kleine BCR/ABL-positieve populatie (0,8%) die beide konden worden beschouwd binnen het vals-positieve percentage van de VISANALYSE. Het Duet™ – systeem heeft echter aangetoond dat een groot deel van de XY-ontvangende cellen blasten waren (en ook BCR/ABL-positief door een tweede FISH-test op dezelfde cellen) en kon dus voorspellen dat de patiënt voorbestemd is om terug te vallen. De identificatie van een kleine ontvangende populatie binnen volwassen hematopoëtische cellen kan geen terugval voorspellen. Bij drie extra patiënten (gegevens niet getoond) hebben we continue remissie gedocumenteerd in de aanwezigheid van een kleine recipiente populatie met volwassen morfologie. Studies op grotere schaal met een langere follow-up zijn nodig om de associatie te bevestigen tussen morfologie van residuele gastheercellen en terugvalrisico bij patiënten zonder andere unieke markers voor de maligne kloon.
het systeem is relatief eenvoudig te bedienen, is meestal automatisch, de uitlooptijd en kosten zijn vergelijkbaar met andere systemen voor chimerisme en MRD-detectie zoals standaard FISH en PCR en het kan geschikt zijn voor grootschalige tests. Behalve de hardware en kits van het systeem is alleen standaarduitrusting nodig die gemakkelijk verkrijgbaar is in grote laboratoria (zie bijlage).
de laatste jaren heeft de studie van chimerisme binnen verschillende cellulaire subsets aan interesse en populariteit gewonnen.Dit is van het grootste belang na niet-myeloablatieve transplantaties.2 sommige groepen hebben aangetoond dat volledig chimerisme in de T-lymfocyten nodig is voor de inductie van GVL, en daarom kan MC in deze cellulaire subgroep geassocieerd worden met een verhoogd risico op recidief, vooral van agressieve, snel groeiende maligniteiten.2,19 Chimerisme testen van cellulaire subsets vereist omslachtig en tijdrovend sorteren van cellen met het theoretische potentieel om sommige cellen te verliezen tijdens dat proces. Zoals besproken in de bijlage veroorzaakt de bereiding van dia ‘ s voor Duet™ – analyse geen verlies of vermindering van een cellulaire populatie. Het duet™ – systeem gebruikt de MGG bevlekte dia om lymfocyten en andere cellulaire subsets te lokaliseren en kan immunocytochemische vlekken (zoals anti-CD3 monoclonal antilichamen) ook gebruiken om deze cellen te lokaliseren. In een tweede fase, kunnen vissen worden toegepast voor chimerisme testen in geslacht-mismatched transplantaties. De case-presentatie van patiënt 3 laat zien hoe het systeem werd gebruikt om chimerisme te volgen bij een patiënt na een niet-myeloablatieve transplantatie en hoe conversie naar volledig chimerisme na ontwenning van ciclosporine het optreden van GVHD-en GVT-responsen voorspelde.
dit rapport richt zich op het gebruik van Duet™ na beenmergtransplantatie, maar er kunnen nog veel andere implicaties zijn. Het systeem kan ook helpen bij de studie van de cellen en geslachten die een unieke cytogenetische of immunofenotypische marker, zoals BCR/ABL fusie (Zoals Gezien In patiënt 1) en correleren hun morfologie met terugval risico na standaard chemotherapie. Het kan helpen om de aard van MRD bij verschillende maligniteiten te onthullen en waarom MRD-detectie niet altijd voorspellend is voor recidief. In bepaalde omgevingen kunnen kleine populaties van donorcellen of microchimerisme worden gezocht. Bijvoorbeeld, kan systemisch lympho-hematopoietic microchimerisme ontdekt na stevige orgaantransplantatie tolerantie aan het getransplanteerde orgaan voorspellen en de immunosuppressieve therapie leiden.Kleine moederpopulatie die allografts uit navelstrengbloed verontreinigt, kan op vergelijkbare wijze worden gedetecteerd en kan gevolgen hebben voor het risico na transplantatie voor GVHD.
samenvattend kan het Duet™-systeem, door morfologische analyse toe te voegen van kleine populaties cellen met maligniteit of recipiente-geassocieerde markers, de nauwkeurigheid van chimerisme en MRD-testen verbeteren en hun klinische significantie bepalen. Dit systeem verdient verdere studie in grootschalige proeven.