Chimeras

wat u wilt geven deel i

• een rekeningnummer.
• een mycoplasma-vrije ES-cellijn met 40 chromosomen.

Wat Zullen We doen

• we zullen ongeveer 50 blastocysten per cellijn injecteren. Dit zou moeten resulteren in 10 muizen geboren. Van drie muizen wordt verwacht dat het sterke mannelijke chimera ‘ s zijn. We hebben bewezen succesvol te zijn.
• we zullen de muizen huisvesten tot het spenen (drie weken na de geboorte).

wat u geeft Deel II

• u zult de gespeende muizen huisvesten.

kosten

• $ 3.300 per 129 cellijn en de kosten van vrouwelijke donors; $ 4.950 per cellijn en de kosten van vrouwelijke donors voor andere genetische achtergronden.
• lokale, niet-CWRU-bestellingen worden 200 dollar extra in rekening gebracht voor het verpakken en vervoeren van muizen. Niet-lokale bestellingen worden in rekening gebracht $ 200 en de kosten van het vervoer.

naleving van de regelgeving

• onderzoekers hebben een IACUC-protocol van hun instelling nodig om muizen uit de kern te ontvangen. CWRU iacuc protocollen moeten het gebruik van de Case transgene kern specificeren. Onderzoekers hebben normaal gesproken geen eigen IBC-protocol nodig: de beoordeling van recombinant DNA bij dieren zal worden uitgevoerd op de informatie die via online bestelling voor de transgene kern wordt ingediend, en zal worden toegevoegd aan het IBC-protocol van de kern als een wijziging indien goedgekeurd. U kunt gecontacteerd worden door het IBC voor aanvullende informatie als onderdeel van rDNA beoordeling na het indienen van de bestelling. IBC-goedkeuring is vereist voordat de injecties worden gestart.

Dankbetuigingen

• Wij verzoeken u de transgene en gerichte Case-faciliteit in seminars en publicaties te erkennen.

tijdlijn

• vanaf de injectiedatum van de cellen zal het minimaal 6 weken duren voordat wij muizen bij u kunnen afleveren (bijna 3 weken voor de dracht en ten minste 3 weken postnatale groei vóór het spenen). Het zal nog 6 weken duren voordat de mannelijke chimera ‘ s oud genoeg zijn om zich voort te planten, en een minimum van nog 6 weken voordat je nakomelingen hebt gespeend tot genotype om te testen op kiemlijn transmissie-in totaal 4.5 maanden vanaf injectie tot het testen van kiemlijntransmissie.
• de huidige (3/25/21) verwachte tijd tussen plaatsing van de bestelling en injectie van ES-cellen is 8 weken. Gedurende de 8 weken voorafgaand aan de injectie wordt het chimera-verzoek beoordeeld door het rDNA-Comité van het IBC, worden de ES-cellen ontdooid en gekweekt en worden muizen besteld en ontvangen.

bij het genereren van Chimerische Muizen

genereert de kern gemiddeld ongeveer 5 chimera ‘ s per cellijn.

aan de slag
de waarschijnlijkheid van kiemlijnoverdracht van een gerichte mutatie wordt verhoogd met het aantal onafhankelijke ES-cellijnen dat beschikbaar is. Gemiddeld, ongeveer twee derde tot driekwart van ES cellijnen op de 129 genetische achtergrond zal gaan kiemlijn. Voor ES-cellijnen op de C57-achtergrond gaat gemiddeld slechts de helft tot twee derde van de lijnen kiemlijn. Daarom, als u gerichte ES-cellijnen koopt van een publieke repository, raden we u aan 3 of meer correct gerichte lijnen te kopen op de 129 achtergrond, en 4 of meer regels op de C57 achtergrond. Bestel ook 2 of meer injecties voor 129 lijnen en 3 of meer voor C57 lijnen. Voor het genereren van weefselspecifieke knockouts met voorwaardelijke allelen in ES-cellen van EUCOMM, zie onze primer.

Veelgestelde vragen

wat zijn chimeras?
chimera ‘ s worden meestal gemaakt om muizen te genereren uit Gen-gerichte of Gen-gevangen ES-cellijnen. ES-cellen die in gastheerembryo ‘ s worden geïnjecteerd, geven aanleiding tot mozaïekmuizen die chimeras worden genoemd.
mannelijke ES-cellen worden geïnjecteerd in ongesekste blastocysten. Als het gastheerembryo vrouwelijk is en de mannelijke ES-cellen kiemcellen maken, zal de chimera vaak een vruchtbaar mannetje zijn. Gastheerembryo ‘ s van een stam die niet te sterk zal concurreren met de ES-cellen worden gebruikt, en de twee componenten (ES en gastheerembryo) zijn genetisch gemarkeerd met vachtkleurgenen zodat de bijdrage van de ES-cellen aan het dier gemakkelijk kan worden bepaald. Als het aandeel van de afstammelingen van ES-cellen in de vacht van het dier hoog is, is de kans dat ES-cellen in gameten worden vertegenwoordigd ook hoog, aangezien ES-cellen zich grondig mengen met gastheercellen vroeg in de embryogenese. Het vachtkleurmarkeringssysteem maakt het ook mogelijk om met de juiste kruisingen te bepalen of de nakomelingen van de chimera ‘ s afkomstig zijn van de ES-celcomponent of de gastheerembryo-component.

129 ES-cellen geven een bruine vachtkleur omdat ze a/A (wild type Agouti) zijn, en de c57bl/6J-gastheerembryo ‘ s geven een zwarte vachtkleur omdat ze A/a (recessieve nonagouti) zijn. De ES-cellen zijn afkomstig van de 129-stam van muizen; de gastheerembryo ‘ s zijn afkomstig van de c57bl/6J-stam van muizen. Als deze chimera ‘ s zijn gefokt op a/a non-agouti muizen (bijvoorbeeld C57BL/6J, dan moet elk bruin nageslacht (A/a) zijn voortgekomen uit ES-cel-afgeleide gameten, en 50% van de bruine nakomelingen wordt verwacht dat het knockout-allel draagt. Alternatief, kan de transmissie van de verandering direct door PCR of Zuidelijke vlekanalyses van weefsels van de nakomelingen worden bepaald.
als de ES-cellen afkomstig zijn van de stam c57bl/6J (a/a, Tyr/Tyr en black), is het gastembryo albino C57BL/6J (A/a, Tyrc-2J / Tyrc2-J en white). Het fokken van dergelijke chimera ‘ s tot albino C57BL/6J kan zwarte Nakomelingen (A/a, Tyr/Tyrc-2J) genereren uit de ES-celcomponent, waarvan 50% de mutatie moet dragen, en witte Nakomelingen (A/a, Tyrc-2J/Tyrc-2J) uit de gastheerembryocomponent.
de mannelijke chimera ‘ s die de beoogde mutatie waarschijnlijk overdragen, kunnen worden geïdentificeerd door middel van copulatoire plug genotypering.

Chimeras voor ander gebruik
wij maken ook aggregatiechimeras en diploidtetraploïde chimeras. Twee pre-implantatie embryo ‘ s van twee verschillende stammen van muizen worden gecombineerd om een aggregatie chimera te vormen. Deze technologie kan worden gebruikt om genetische mozaïekembryo ‘ s voor analyse van autonomie en nonautonomy van genactie en andere experimentele doelstellingen te produceren. In diploidtetraploïde chimeras, geeft de tetraploïde component grotendeels aanleiding tot veel van de embryo-afgeleide placenta en de diploïde component aan het embryo. Dit type van chimera kan worden gebruikt om te bepalen of een gen in placenta of embryo wordt vereist.

Waarom zijn mijn muizen grappige kleuren?
sommige ES-cellijnen zijn heterozygoot voor allelen van de vachtkleur die zich pas in volgende generaties openbaren. De R1 129 ES cellen die we gebruiken zijn heterozygoot bij Albino locus, met één kopie van chinchilla allel van albino (CCH, ook aangeduid als Tyrc-ch) en zijn heterozygoot bij de roze-eyed verdunning locus (p). Het kweken van nakomelingen die afstammen van R1 ES cellen naar elkaar kan leiden tot muizen die Zwart, verschillende tinten grijs, verschillende tinten bruin, of geel, afhankelijk van het assortiment van vachtkleur allelen.

wat kan worden gedaan om de kiemlijnoverdracht te waarborgen?
Kiembaantransmissie wordt gemaximaliseerd met ES-cellen die een minimum aan tijd in cultuur hebben doorgebracht, een normale samenstelling van chromosomen hebben en vrij zijn van gist, bacteriën en mycoplasma. Richt je op een cellijn waarvan je weet dat die wordt verzonden onder jouw omstandigheden in je instelling. Gebruik een oudercellijn met het laagste beschikbare passage nummer (bij voorkeur minder dan passage nummer 16). Minimaliseer de tijd dat de doellijn wordt gekweekt. Controleer of de gerichte cellijnen het normale aantal chromosomen hebben. Test je cellijn op mycoplasma. Sommige cellijnen zullen niet verzenden, zelfs als al deze parameters in uw voordeel zijn. Zelfs onder optimale omstandigheden, slechts twee derde van gerichte ES cellijnen zal worden overgedragen door de kiemlijn. Begin daarom met ten minste drie onafhankelijke gerichte cellijnen om transmissie te garanderen.

ik heb zwakke chimera ‘s/vrouwelijke chimera’ s. Zenden ze de knock-out uit?
zowel zwakke chimera ’s als vrouwelijke chimera’ s kunnen mutante allelen overdragen, zij het zelden. De mannelijke chimeras die waarschijnlijk de gerichte verandering overbrengen kunnen door copulatory plug genotyping worden geà dentificeerd. Slechts ongeveer 10% van de vrouwelijke chimera ‘ s zenden het Es-celgenoom, wanneer ze dat doen is het alleen in de eerste paar nesten, en veel van hun mannelijke nakomelingen hebben geslachtschromosoom aneuploidies die hen onvruchtbaar maken (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

Waarom zijn mijn sterkste chimera ‘ s gestorven?
sterfte kan toenemen met het aandeel van het dier dat afkomstig is van ES-cellen, zelfs voor de beste cellijnen. Deze sterfte is grotendeels te wijten aan epigenetische aberraties die ontstonden in de cultuur. De epigenetische aberraties worden verondersteld te worden gecorrigeerd door het volgende fokken van overlevende muizen, en zou willekeurig scheiden van de beoogde locus, zelfs als ze niet waren.

tot welke stam van muizen fok ik mijn mutanten?
om de genetische variabiliteit zo snel mogelijk te minimaliseren broeden de chimera ‘ s op dezelfde achtergrond als de ES-cellen. Als de ES cellen 129 waren, kweek de chimera ‘ s tot 129 muizen en je mutatie zal volledig op de 129 inteelt achtergrond staan in één stap. De meest voorkomende inteelt achtergrond voor genetische studies is de c57bl / 6 stam. Als je ES cellen c57bl/6 zijn, kruis dan je chimeras naar c57bl / 6J muizen. Als je de achtergrond wilt veranderen, is de standaard om 9 seriële kruisen te doen naar de inteeltsoort naar keuze (ongeveer 2,5 jaar). De reden voor de 9 generaties wordt hier uitgelegd door Lee Silver. Als alternatief is ongeveer de helft van het aantal generaties vereist voor de rugkruis met behulp van markeringen, of de congenicas van de snelheid.Voor maximale voortplanting kruist u uw muizen over op een soort zoals CD1. CD1 muizen werden afgeleid van Zwitserse muizen, hebben een hoge mate van genetische variatie en werden geselecteerd voor robuuste reproductie.

ES-cellen met voorwaardelijke allelen van EUCOMM
elke cellijn van EUCOMM vereist dat u een Overeenkomst voor de overdracht van materialen voltooit. Start dit proces zo vroeg mogelijk.
de generatietijd van muizen en het aantal kruisingen dat nodig is om de experimentele muizen te genereren, combineren een lange tijd die verrassend is voor degenen die niet gewend zijn aan muizengenetica, dus plan vooruit. De generatietijd van muizen (de tijd van geslachtsrijpe volwassen tot geslachtsrijpe nakomelingen) is ongeveer 3 maanden.
de voorwaardelijke EUCOMM-allelen hebben doorgaans een Frt-flanked cassette (een” Frt-ed ” cassette). De cassette heeft een splice acceptor die vrijwel alle splicing leidt in de cassette, waardoor het allel een verlies-van-functie mutatie in deze configuratie. Om het voorwaardelijke allel te genereren, moet de Frt-geflankeerde cassette worden verwijderd door te kruisen naar Flpe-expresserende muizen. Het Flpe / Frt-systeem is vergelijkbaar, maar verschilt van het Cre / LoxP-systeem.
we injecteren de ES-cellen in gastembryo ‘ s om chimerische muizen te maken. Van daaruit zal je de muizen fokken om muizen te genereren die de mutatie dragen (kiemlijn transmissie). Deze stichtersgeneratie van muizen kan worden gekruist naar muizen die Flpe uitdrukken om de Frt-ed cassette te verwijderen, waardoor het voorwaardelijke allel wordt gegenereerd. Dan moet je nog een aantal kruisen doen om de experimentele muizen te genereren.

1. van ES-celinjectie tot volwassen geslachtsrijpe chimera ‘ s is de generatietijd van muizen (3 maanden).
2. de chimera ‘ s worden gefokt op wilde muizen om de mutant in de kiemlijn (3 maanden) vast te stellen.
3. de heterozygote FRTD voorwaardelijke muizen worden gekruist naar Flpe die homozygoten uitdrukt. Dit genereert Flpe / o, frtd voorwaardelijk / + Nakomelingen. (3 maanden)
4. de Flpe/o, frtd voorwaardelijke/+ muizen worden gekruist naar het wildtype om het geëxciseerde allel in de kiemlijn vast te stellen en Flpe te fokken, en de uitsnijding wordt moleculair geverifieerd bij deze voorwaardelijke/+ muizen (3 maanden).
5. de voorwaardelijke / + muizen werden vervolgens op elkaar gefokt om homozygote voorwaardelijke allel muizen te maken (3 maanden).
6. de voorwaardelijke / voorwaardelijke muizen worden gefokt tot weefselspecifieke-Cre/ weefselspecifieke-Cre, nul/+ muizen om de experimentele weefselspecifieke-Cre/o, voorwaardelijke/nul-muizen en controleweefselspecifieke-Cre/ o, voorwaardelijke / + muizen te maken.

bovendien moeten de Fple -, null -, Cre-muizen worden verkregen, moeten de weefselspecifieke-Cre/ weefselspecifieke-Cre -, null / + – muizen worden gefokt.
ook moet het voorwaardelijke allel worden geanalyseerd om te bepalen of het wild type in functie is vóór excisie met Cre, En null na excisie met Cre. Om te bepalen of het voorwaardelijke allel wild type in functie is vóór excisie, moeten voorwaardelijke/voorwaardelijke en voorwaardelijke/null-mutanten worden onderzocht om te bepalen of hun fenotype hetzelfde is als respectievelijk de +/+ EN null/+ muizen. Om te bepalen of de CRE-exised conditional een nul-allel is, wordt de voorwaardelijke voorwaarde gekruist naar een kiemlijn cre-muis en worden de exised conditional-conditionals gekruist om te testen of het fenotype van exised conditional/exised conditional gelijk is aan nul/nul en/of dat er geen eiwit wordt gemaakt van het exised conditional-allel.
een verslaggeefster van Cre-activiteit zoals RosaReporter, of beter gezegd, die rechtstreeks aantoont dat het betrokken eiwit door immunofluorescentie afwezig is in de doelcellen, is een belangrijke controle. RosaReporter genereert permanente bèta-galactosidase expressie in alle cellen die werden blootgesteld aan Cre.
excessieve Cre-expressie kan leiden tot chromosoombreuk die fenotypen kan veroorzaken die geen verband houden met de functie van het voorwaardelijke allel. Daarom zijn broer-of zus muizen die Cre uitdrukken maar één of andere genfunctie behouden (bijvoorbeeld voorwaardelijke/+) een belangrijke controle.