1.4.1 Homogenisatiemedium
Cell disruption wordt gewoonlijk uitgevoerd in een licht hypo-osmotisch of een iso-osmotisch medium om de morfologische integriteit te behouden. Sucrose wordt algemeen gebruikt als osmoticum om subcellular organellen of blaasjes van ongunstige het zwellen of krimp te verhinderen. Mannitol en sorbitol zijn ook gebruikt wanneer blijkt dat sucrose interfereert met de biochemische analyse van de subcellulaire component. Sucrose heeft de voorkeur boven zoutoplossingen omdat deze laatste de neiging hebben om subcellulaire organellen samen te voegen. Hypo-osmotische media worden vaak gebruikt in de isolatie van plasma membraanfracties omdat onder deze omstandigheden, verstoorde cellen produceren plasma membranen in de vorm van grote spoken of platen. Dit vermindert beduidend de hoge graad van variatie in grootte van deze fragmenten voorafgaand aan centrifugatie. Hoewel het homogenisatiemedium gewoonlijk waterig van aard is, zijn niet-waterige media zoals ether/chloroform gebruikt om subcellular organellen te isoleren. Niet-waterige media kunnen echter sommige enzymen inactiveren en de morfologische integriteit van sommige weefsels verminderen.
chelaatvormers (EDTA of EGTA) kunnen aan het homogenisatiemedium worden toegevoegd om divalente kationen, zoals Mg2+ of Ca2+, die nodig zijn voor membraanproteasen, te verwijderen. Het is belangrijk op te merken dat proteaseremmers nog steeds in het medium moeten worden opgenomen omdat EDTA-en thiol-reagentia sommige proteolytische enzymen kunnen activeren. Nochtans, vereisen vele membraanmerkerenzymen deze kationen voor Activiteit en kunnen worden geremd nadat de kationen uit het extract zijn verwijderd. De toevoeging van Mg2 + of Ca2+ aan het homogenisatiemedium handhaaft de nucleaire integriteit. Nochtans, kunnen deze ionen membraanaggregatie veroorzaken en ademhalingscontrole in mitochondria verminderen.
celdruk van plantenweefsel geeft vaak fenolen vrij die verschillende schadelijke effecten op plantaardige enzymen kunnen hebben. Plantaardige fenolverbindingen omvatten in wezen twee groepen: fenylpropanoideverbindingen (b. v.hydrolyseerbare tannines) en flavonoïden (b. v. gecondenseerde tannines). De fenolen kunnen waterstof binden met peptidebindingen van eiwitten, of oxidatie ondergaan door fenoloxidase aan chinonen. Quinonen zijn krachtige oxiderende agenten die ook de neiging hebben om te polymeriseren en te condenseren met reactieve groepen proteã nen om een donker pigment genoemd melanine te vormen dat de basis vormt van het bruinen van plantenweefsel. De gehechtheid van melanine aan proteã nen kan vele enzymen inactiveren. Fenolische hydroxylgroepen kunnen Ionische interacties met basische aminozuren van eiwitten vormen of hydrofoob interageren met hydrofobe gebieden van eiwitten. Daarom is het belangrijk om de fenolverbindingen zo snel mogelijk te verwijderen en dit kan het best worden bereikt door gebruik te maken van adsorbenten die zich binden aan de fenolen of chinonen of door gebruik te maken van beschermende middelen zoals boraat, germanaat, sulfieten en mercaptobenzothiazool die de fenoloxidase-activiteit remmen. Het fenoladsorbens polyvinylpyrrolidon in wateroplosbare vorm of als het sterk Vernet onoplosbare product “Polyclar” kan aan het isolatiemedium worden toegevoegd. Polyvinylpyrrolidon bindt fenolverbindingen die sterke waterstofbindingen met eiwitten vormen. Bovine serum albumine is ook gemeld om te reageren met plantaardige fenolen en is ook een effectieve quinon aaseter.
cel-of weefselfractionering wordt steevast uitgevoerd bij +4°C om de activiteit van membraanproteasen te verminderen. Proteasen kunnen worden onderverdeeld in endopeptidasen en exopeptidasen. Endopeptidases, die enzymen zijn die interne peptide banden splijten, omvatten: zure proteasen die een pH optima van pH 2.5-3.8 hebben en door de inhibitor pepstatin van de overgangsstaat kunnen worden geremd; serineproteasen die geremd kunnen worden door diisopropylfluorofosfaat en fenylmethylsulfonylfluoride; en sulfhydrylproteasen die geremd worden door N-ethylmaleimide of E-64 (l-trans-epoxysuccinyl-leucylamide-butaan). De voorbeelden van exopeptidases omvatten carboxypeptidases die in de meeste installatieweefsels aanwezig zijn en gemakkelijk de meeste C-eindaminozuren hydrolyseren. Alle tot op heden bestudeerde plantencarboxypeptidasen worden geremd door diisopropylfluorofosfaat. Aminopeptidasen, dipeptidasen en tripeptidasen zijn ook geïdentificeerd in planten. Andere verbindingen die in homogenisatiemedia worden gebruikt omvatten disulfide-reducerende agenten zoals 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, dithioerythritol, verminderde glutathion of cysteïne. Dit komt omdat veel enzymen een essentiële actieve sulfhydrylgroep bevatten die gereduceerd moet blijven om de enzymactiviteit op peil te houden. Veel van de problemen van organelisolatie worden geassocieerd met het scheuren van de fragiele membranen, bijvoorbeeld de tonoplast rond de vacuole. Naast de fysieke vernietiging van deze membranen bevatten plantaardige weefsels actieve lipolytische enzymen die de lipidecomponenten van membranen direct kunnen aanvallen en organellen kunnen verstoren. Vrije vetzuren die door de hydrolytische werking van acylhydrolasen worden vrijgegeven kunnen ATPase-activiteiten van mitochondriën, chloroplast en plasmamembraan remmen. Andere schadelijke effecten van vetzuren zijn ook goed gevestigd. Er zijn bepaalde voorwaarden die lipidenafbraak door lipasen en lipolytische acylhydrolasen in installaties kunnen verminderen. Deze omvatten het gebruik van (1) een isolatiemedium met een pH van 7.5-8 waarbij de meeste lipolytische enzymen en lipooxygenasen weinig activiteit vertonen, (2) chelaatvormers zoals EDTA omdat veel fosfolipasen Ca2+ afhankelijk zijn; veel lipolytische enzymen worden echter niet beïnvloed door chelaatvormers en (3) andere additieven zoals antioxidanten om oxidatieve afbraak van vetzuurhydroperoxiden, disulfidereducerende middelen, specifieke enzymremmers en het gebruik van vetzuurvrije runderserumalbumine die vrije vetzuren bindt. Elk individueel homogenisatiemedium is verschillend en kan specifieke inhibitors voor enzymen zoals fosfolipasen of phos-phatases bevatten. Glycerol bijvoorbeeld, wordt vaak toegevoegd aan het isolatiemedium om fosfatidinezuur fosfatase te remmen. Ethanolamine en cholinechloride worden gewoonlijk gebruikt om fosfolipase D te remmen.
de buffercapaciteit van het homogenisatiemedium voor fractionering van plantencellen moet hoog zijn om de afgifte van organische zuren door de verstoorde vacuole, die een aanzienlijk volume van de cel vormt, te compenseren. Het homogenisatiemedium kan ofwel door empirische evaluatie of door rationele analyse worden geformuleerd. Bijvoorbeeld, om ervoor te zorgen dat de relevante gezuiverde proteã ne intact blijft kunnen alle belangrijke inhibitors van proteasen aan het homogenisatiemedium worden toegevoegd of alternatief fysiologische oplossingen worden gekopieerd. Aangezien de cytoplasmatische pH van de plantencel rond 7,5-8,0 ligt, moet het homogenisatiemedium de fysiologische toestand van de cel weerspiegelen en wordt het daarom zwak gebufferd tot de cytoplasmatische pH.