Één mutatie in een sterk geconserveerde regio van chloramphenicol acetyltransferase kunnen isobutyl-acetaat direct voor productie van cellulose door Clostridium thermocellum bij verhoogde temperaturen

Bacteriële stammen en plasmiden

Bacteriële stammen en plasmiden gebruikt in dit onderzoek zijn vermeld in Tabel 2. De spanning van Clostridium thermocellum DSM1313 ∆HPT (M1354) werd gebruikt als gastheer voor de esterproductie bij opgeheven temperaturen. Opgemerkt moet worden dat de deletie van hypoxanthinefosforibosyltransferasegen (HPT, Clo1313_2927) in het wild-type DSM1313 genetische manipulatie door 8-azahypoxanthine (8-AZH) teller selectie mogelijk maakt; deze deletie heeft geen bekende nadelige gevolgen voor de celgroei en het metabolisme . Het plasmide pNW33N, dat CATSa bevat, is thermostabiel en werd gebruikt om verschillende katten in C. thermocellum tot expressie te brengen. De pET plasmiden werden gebruikt voor het moleculaire klonen en enzym expressie in E. coli.

chemische stoffen en reagentia

alle chemische stoffen zijn gekocht bij Sigma-Aldrich (MO, VS) en/of Thermo Fisher Scientific (MA, VS), tenzij elders vermeld. Voor moleculair klonen werden restrictie-enzymen en T4 ligase verkregen uit New England Biolabs (MA, USA). Phusion heet begin II de polymerase van DNA werd gebruikt voor polymerasekettingreactie (PCR).

Media en teelt

voor moleculair klonen en eiwitexpressie werden E. coli stammen gekweekt in lysogeniebouillon (LB) die geschikte antibiotica bevatten, tenzij anders aangegeven. Voor de in vivo karakterisatie van CATSa in E. coli werd M9 hybride medium met 20 G/L glucose gebruikt. Voor C. thermocellum cultuur werd MTC minimaal medium of CTFuD-NY medium gebruikt zoals gespecificeerd in de experimenten. De optische dichtheid (od) werd gemeten met een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Multiple sequence alignment analysis

Multiple sequence alignment (MSA) analyse werd uitgevoerd met MEGA7 . Eiwitsequenties werden uitgelijnd door ClustalW en gevisualiseerd door ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . De belangrijkste kenmerken in eiwitstructuren van 3U9F, 4CLA en 2XAT werden geëxtraheerd uit respectievelijk CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX en CAT4_PSEAE.

moleculaire modellering en docking simulaties

driedimensionale (3D) structuren

de 3D-structuur van catsa en alcoholen van belang werd voor het eerst gegenereerd met behulp van Swiss-Model en de ‘Builder’ tools van MOE (Molecular Operating Environment software, Versie 2019.01), respectievelijk. De 3D-structuur van het Dual substrate-bounded catsa–complex (d.w.z. acetyl–CoA–Isobutanol-CATSa) werd verkregen door een isobutanol uit het isobutanol–CATSa-complex te extraheren en het vervolgens toe te voegen aan het acetyl-CoA-CATSa-complex. Alle structuren werden voorbereid door de’ QuickPrep ‘ – tool van MOE met standaardparameters en verder geoptimaliseerd door energieminimalisatie met het amber10:EHT krachtveld.

Docking simulatie

om docking simulaties uit te voeren, werd het potentiële bindingsvak doorzocht met behulp van de ‘Site Finder’ tool van MOE. De best gescoorde plaats, consistent met de gerapporteerde katalytische plaatsen , werd geselecteerd voor verdere studies. Docking simulaties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven . In het kort werden acetyl-CoA en elke alcohol gedockt met behulp van het induced fit protocol met de Triangle Matcher placement method en de London ΔG scoringfunctie. Na de docking simulaties werd de best gescoorde bindingspositie gekozen, die de cruciale interactie tussen het residu en het substraat bij wortel-gemiddelde-kwadraat-afwijking (rmsd) < 2 Å weergeeft. Als voorbeeld, voor het acetyl-CoA docking, werd de band die de waterstofband tussen hydroxyl van Ser-148 en N71 van CoA tentoonstellen gekozen . Voor de alcoholdocking werd gekozen voor de bindingspositie die de waterstofbinding tussen de N3 van His-189 en de hydroxyl van alcohol laat zien .

in silico mutagenese analyse

In silico mutagenese analyse van het acetyl-CoA–isobutanol–CATSa complex werd uitgevoerd zoals eerder beschreven . Specifiek, werden de ‘alanine scan ‘en’ residu scan ‘ tools van MOE gebruikt om de potentiële residu kandidaten voor mutagenese te identificeren.

moleculair klonen

Plasmideconstructie

plasmiden werden geconstrueerd door de standaard moleculair klonen techniek van ligase afhankelijke methode en / of Gibson assemblage met behulp van de primers vermeld in aanvullend bestand 1: tabel S1. De geconstrueerde plasmiden werden geà ntroduceerd in E. coli TOP10 door hitteschoktransformatie. Kolonies geïsoleerd op een selectieve plaat werden PCR gescreend en plasmide gezuiverd. De gezuiverde plasmiden werden geverifieerd via sanger die alvorens in E. coli BL21 (DE3) worden omgezet rangschikken. Site-directed mutagenese werd uitgevoerd met behulp van het QuickChange™ site-directed mutagenese protocol met gereduceerde overlap lengte of Gibson assemblage methode . Voor de C. thermocellum engineering werd eerst de plasmide pHS005 gebouwd en vervolgens aangepast aan pHS0024. pHS0024 heeft geen HPT aan de stroomafwaarts van het operon, terwijl andere opeenvolgingen van het plasmide identiek zijn aan pHS005.

transformatie

de conventionele chemische transformatie en elektroporatie methoden werden gebruikt voor de transformatie van respectievelijk E. coli en C. thermocellum. Voor C. thermocellum, de methode, echter, werd enigszins gewijzigd zoals hier beschreven. Ten eerste, C. thermocellum M1354 (Tabel 2) werd gekweekt in 50 mL CTFuD-NY medium bij 50 °C in een anaërobe kamer (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., OF, USA). De celcultuur met OD in een waaier van 0.8-1.0 werd afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Daarna werden alle stappen buiten de kamer uitgevoerd. De gekoelde cellen werden gedurende 20 minuten geoogst bij 6500×g en 4 °C. De celkorrels werden tweemaal gewassen met Ijsgekoeld Milli-Q water en geresuspendeerd in 200 µL van de transformatiebuffer bestaande uit 250 mM sucrose en 10% (v/v) glycerol. Verscheidene 30 µL aliquots van de elektrocompetente cellen werden onmiddellijk opgeslagen bij-80 °C voor verder gebruik. Voor elektroporatie werden de elektrocompetente cellen ontdooid op ijs en gedurende 10 minuten geïncubeerd met 500-1000 ng geméthyleerde plasmiden. Vervolgens werden de cellen overgebracht naar een ijskoude 1-mm gap electroporation cuvette (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) gevolgd door twee opeenvolgende exponentiële vervalpulsen met 1.8 kV, 350 Ω en 25 µF. De pulsen resulteerden meestal in een 7.0-8.0 ms tijdconstante. De cellen werden onmiddellijk geresuspendeerd in voorverwarmde verse CTFuD-NY en teruggewonnen bij 50 °C onder anaërobe conditie (90% N2, 5% H2 en 5% CO2) in een Balch tube met rubberen dop. Na 0-12 uur herstel werden de cellen gemengd met gesmolten CTFuD-NY agarmedium aangevuld met 15 µg/mL thiamfenicol. Ten slotte werd het medium-celmengsel op een petrischaal gegoten en in de anaërobe kamer gestold. De plaat werd geïncubeerd bij 50 °C tot 1 week totdat kolonies verschenen. De omzettingsefficiëntie was 2-100 kolonievormende eenheden per µg plasmide (CFU/µg plasmide).

in vivo karakterisatie van CATSa en zijn varianten in E. coli

voor in vivo karakterisatie van CATSa en zijn varianten in E. coli werden culturen met hoge celdichtheid uitgevoerd zoals eerder beschreven met een toevoeging van 2 g/L van verschillende alcoholen. Voor in situ extractie van esters werd elke buis bedekt met 25% (v/v) hexadecaan. Om de eiwitexpressie van CATSa en zijn varianten te bevestigen, werd 1% (v/v) van de stamcellen ‘ s nachts bij 37 °C en 200 rpm gekweekt in 15 mL kweekbuisjes met 5 mL lb medium en antibioticum. Vervolgens werd 4% (v / v) van de ‘ s nachts culturen overgebracht naar 1 mL lb medium met antibioticum in een 24-Wells microplaat. De culturen werden gekweekt bij 37 °C en 350 rpm met behulp van een incuberende microplaat shaker (Fisher Scientific, PA, USA) tot OD bereikte tot 0,4–0,6 en vervolgens geïnduceerd door 0.1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) gedurende 4 uur met een adem-Easy Afdichtingsmembraan om verdamping en kruisbesmetting te voorkomen (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). De eiwitmonsters werden verkregen met behulp van het B-per Complete reagens (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA), volgens de instructies van de fabrikant en geanalyseerd door SDS-PAGE.

Enzymkarakterisatie

his-tag zuivering

voor de enzymexpressie werd een nachtkweek geïnoculeerd met een:50 verhouding in vers lb medium met 1 mM IPTG en antibioticum, gevolgd door 18 °C ‘ s nachts incubatie (tot 20 uur) in een schudden incubator bij 200 rpm. De geïnduceerde cellen werden geoogst door centrifugeren bij 4 °C en 4700×g gedurende 10 minuten. De celpellet werd vervolgens eenmaal gewassen met Millipore water en geresuspendeerd in het B-per complete reagens. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur werd het mengsel gedurende 2 minuten gecentrifugeerd bij 17.000×g. Het supernatant werd verzameld en aangeduid als ruw extract. Voor zijn-tag zuivering, werd het ruwe extract geïncubeerd met HisPur Ni–NTA superflow agarose in een batch zoals de fabrikant aanbeveelt. Vervolgens werd de hars gewassen met ten minste drie volumes wash buffer, bestaande uit 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol en 0,1 mM EDTA. De aan hars gebonden eiwitten werden geëlueerd door 300 µL elutiebuffer met 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM imidazol en 0,1 mM EDTA. Het geëlueerde monster werd vervolgens ontzouten en geconcentreerd via een Amiconfilterkolom met 10 kDa molecuulgewicht cut-off. Tenslotte werd het eiwitmonster gesuspendeerd in 200 µL Tris–HCl-buffer van 20 mM (pH 8,0). De eiwitconcentratie werd gemeten met de Bradford-test met boviene serumalbumine (BSA) als referentieeiwit.

Thermal shift assay

om de eiwitsmelttemperatuur (TM) te meten, werd een thermofluor assay gebruikt met SYPRO Orange . Ongeveer 10-250 µg van zijn-tag gezuiverd eiwit werd gemengd met 5 × SYPRO Oranje in een 50 µL eindvolume in een 96-well qPCR plaat. De plaat werd verzegeld met PCR-doppen alvorens de analyse uit te voeren. De StepOne real-time PCR-machine (Applied Biosystems, CA, USA) werd gebruikt om de analyse uit te voeren met de volgende parameters: rox reporter, 1 °C-toename per cyclus, 1 min hold bij elke cyclus en temperatuurbereik van 20 tot 98 °C. De gegevens werden verzameld, geëxporteerd en verwerkt om Tm te berekenen.

5,5 ‘ -dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) – test

reactiesnelheid voor elke kat werd bepaald door een dtnb-test in een 384-wells-plaat. Het totale reactievolume was 50 µL met de reactiebuffer bestaande uit 50 mM Tris–HCl (pH 8,0). De concentraties van acetyl-CoA (Coala Biosciences, TX, USA) en alcoholen werden gevarieerd zoals gespecificeerd in elk experiment. Definitieve enzymconcentraties van 0,05 µg/mL en 10 µg / mL werden gebruikt voor de reacties op respectievelijk chlooramfenicol en alcoholen. De reactiekinetiek werd verzameld door het meten van de absorptie bij 412 nm elke minuut gedurende 1 uur bij 50 °C in een microplaatlezer (Synergy HTX microplaatlezer, BioTek). De reactiesnelheid werd berekend met behulp van de extinctiecoëfficiënt van een standaardcurve van vrij co-enzym A (MP Biomedicals, OH, USA) onder dezelfde voorwaarde. Opgemerkt dient te worden dat, aangezien de maximale bedrijfstemperatuur die voor de plaatlezer wordt aanbevolen 50 °C is, de hoge-productie enzymtest voor kat bij verhoogde temperaturen alleen werd uitgevoerd om de enzymkinetische parameters te bepalen.

berekening van kinetische parameters voor reactiesnelheden

de parameters van de Michaelis-Menten snelheidswet (Eq. 1) werden voor elk enzym als volgt berekend. Eerst werd lineaire regressie uitgevoerd op gegevens die werden verzameld met een microplaatlezer om initiële reactiesnelheden te identificeren, \(y_{I}\), bij verschillende initiële substraatconcentraties, \(s_{i}\), waarbij i = {1,2,…, n} het aantal verzamelde datapunten is. Vervolgens werden deze initiële reactiesnelheden en bijbehorende initiële substraatconcentraties voor alle replicaten tegelijkertijd aangepast aan het Michaelis-Menten model (Eq. 1) met behulp van robuuste niet-lineaire regressie (Eq. 2) met een soft-L1-loss estimator (Eq. 3) zoals geïmplementeerd in de scipy numerical computing library v1. 2. 0 :

het kleinste kwadratenprobleem bepaalt de parameters \(K_ {\text{m}}\) en \(v_{ \text{max} }\) door het verschil tussen de model voorspelde reactiesnelheden \(v_{i}\) en gemeten reactiesnelheden \(y_{i}\) (Eq. 2). Een smoothing functie \(\rho \left( z \right)\) wordt gebruikt om het kleinste kwadraat probleem bestand te maken tegen uitschieters (Eq. 3). Door de onbevooroordeelde weerstand tegen uitschieters en het vermijden van fouten als gevolg van conventionele linearisatiemethoden, biedt robuuste niet-lineaire regressie de meest nauwkeurige parameterschatting voor het Michaelis–Menten model .

de productie van isobutylacetaat in C. thermocellum

Cellobiosefermentatie

de productie van isobutylacetaat uit cellobiose in C. thermocellum stammen werd uitgevoerd door de bioconversieconfiguratie in twee stappen. Cellen werden eerst gekweekt in MTC minimaal medium met 5 g/L cellobiose in een met rubber beklede Balch tube totdat de OD 0,8–1 bereikte.0. De cellen werden afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende 20 min en gecentrifugeerd bij 4700×g en 4 °C gedurende 20 min. Na verwijdering van het supernatans werden de cellen geresuspendeerd in hetzelfde volume vers MTC-minimaal medium dat 2 g/L isobutanol bevat in een anaërobe kamer. De celsuspensie werd vervolgens verdeeld in 800 µL in een 2,0 mL schroefdop microcentrifugebuis met een 200 µL hexadecaan overlay. De cellen werden gedurende 24 uur bij 55 °C geïncubeerd, gevolgd door een analyse van gaschromatografie in combinatie met een massaspectrometer (GC/MS) om de geproduceerde hoeveelheid isobutylacetaat te kwantificeren.

Cellulose-fermentatie

voor de cellulose-fermentatie werd gemodificeerd MTC-medium (C-MTC-medium) gebruikt. 20 g / L Avicel PH-101 werd gebruikt als enige koolstofbron in plaats van cellobiose, en 10 g / L MOPS werd toegevoegd om de buffercapaciteit te verhogen. De aanvankelijke pH werd aangepast tot 7,5 bij 5 M KOH en autoclaved. In een anaërobe kamer werd 0,8 mL nachtcelcultuur geïnoculeerd in 15,2 mL C-MTC-medium (1:20-inoculatieverhouding) met 4 mL hexadecaan. Elke buis bevatte een kleine magnetische roerstaaf om cellulose te homogeniseren. De met rubber beklede Balch tube werd geïncubeerd in een waterbad verbonden met een temperatuurregelaar ingesteld op 55 °C en een magnetisch roersysteem. Na pH-aanpassing met 70 µL KOH-injectie van 5 M werden om de 12 uur 800 µL celkweek en 200 µL hexadecaanlaag bemonsterd. de pH–kweek werd tijdens de fermentatie binnen een bereik van 6,4-7,8 gehouden.

de celgroei werd gecontroleerd door het meten van pellet-eiwit. De celcellulosepellet van 800 µL bemonsteringsvolumes werd tweemaal gewassen met Milli-Q water en gesuspendeerd met 200 µL lysis buffer (0.2 M NaOH, 1% SDS) gevolgd door een uur incubatie bij kamertemperatuur. Vervolgens werd de oplossing geneutraliseerd met 50 µL 0,8 m HCl en verdund met 550 µL water. Het mengsel werd gedurende 3 minuten gecentrifugeerd bij 17.000×g. De eiwitconcentratie van het supernatans werd geanalyseerd met de Bradford-test (Thermo Scientific, WA, USA). De resterende pellet werd gekookt in een oven van 98 °C gedurende een uur alvorens de resterende cellulose te kwantificeren.

Restcellulose werd gekwantificeerd met behulp van de fenol–zwavelzuurmethode, met enkele wijzigingen. Het gekookte monster werd tweemaal gewassen met Milli-Q water en gesuspendeerd in 800 µL water om een equivalent volume aan het origineel te maken. Het monster werd gehomogeniseerd door pipetteren en vortexing gedurende 10 s, en 20 µL van het gehomogeniseerde monster werd overgebracht naar een nieuwe 2,0 mL microcentrifugebuis of 96-wells plaat en ‘ s nachts gedroogd in een 55 °C oven. De gedroogde pellet werd gesuspendeerd in 200 µL 95% zwavelzuur en gedurende een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Nadat de pellet volledig was opgelost, werd 20 µL 5% fenol toegevoegd en gemengd met de zwavelzuuroplossing. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur werd 100 µL van het monster overgebracht naar een nieuwe plaat met 96 wells en werd de absorptie bij 490 nm gemeten. De absorptie werd omgezet in cellulose concentratie door de standaard curve van Avicel PH-101 behandeld met dezelfde procedure.

analysemethoden

hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)

extracellulaire metabolieten werden gekwantificeerd met behulp van een hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)-systeem (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µL kweekmonsters werd gecentrifugeerd bij 17.000×g gedurende 3 min, en vervolgens werden de supernatanten gefilterd door 0,2 µm filters en uitgevoerd met 10 mN H2SO4 mobiele fase bij 0,6 mL / min op een Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) kolom bij 50 °C. Brekingsindexdetector (RID) en ultraviolette detector (UVD) bij 220 nm werden gebruikt om concentraties van suikers, organische zuren en alcoholen te controleren.

gaschromatografie in combinatie met massaspectroscopie (GC/MS)

Esters werden gemeten door GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) uitgerust met een MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). Voor het GC-systeem werd de zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) capillaire kolom (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) gebruikt om analyten te scheiden, en helium werd gebruikt als drager met een debiet van 0,5 mL/min. Het oventemperatuurprogramma was als volgt ingesteld: 50 °C begintemperatuur, 1 °c/min helling tot 58 °C, 25 °c / min helling tot 235 °C, 50 ° c / min helling tot 300 °C en 2 minuten bakken bij 300 °C. 1 µL van de bemonsterde hexadecaanlaag werd in de kolom gespleten met een injectortemperatuur van 280 °C. Voor het MS-systeem werd de SIM (selected ion mode) gebruikt om esters met de volgende parameters te detecteren en te kwantificeren: I) ethylacetaat, m/z 45.00 en 61.00 van 4,2 tot 4,6 min retentietijd (RT), ii) isopropylacetaat, m/Z 45 en 102 van 4,7 tot 5,0 min RT, iii) propylacetaat, m/z 59 en 73 van 5,2 tot 5,8 min RT, iv) ethylisobutyraat, m/z 73 en 116 van 6,1 tot 6,6 min RT, v) isobutylacetaat, m/Z 61 en 101 van 6,6 tot 7,6 min RT, (VI) butylacetaat, m/Z 61 en 116 van 7,7 tot 9,2 min RT, (VII) isobutylisobutyraat, m/Z 89 en 129 van 10,1 tot 12.5 min RT, viii) benzylacetaat, m / z 108 en 150 van 13.1 tot 13.8 min RT, en ix) 2-fenethylacetaat, m/z 104 en 121 van 13.8 tot 15.5 min RT. Isoamylalcohol en isoamylacetaat werden gebruikt als de interne standaardanalyten. De esters werden geïdentificeerd door RT en gekwantificeerd door de piekgebieden en standaardkrommen. Standaardkrommen werden bepaald met zuivere esters verdund tot hexadecaan in concentraties van 0,01 g/ L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L en 1 g/L.