under 2009 Brazilian Agricultural Research Corp. (Embrapa) och Brasilia Zoological Garden började rensa och frysa blod, spermier och navelsträngsceller från roadkill och andra vilda djur som hade dött, mestadels i Cerrado savanna—en otroligt mångsidig samling av tropiska skogs-och gräsmarksekosystem hem till minst 10 000 växtarter och mer än 800 arter av fåglar och däggdjur, av vilka några inte bor någon annanstans i världen. Prover samlades in från buskhunden, krage anteater, bison och grå brockethjort, bland andra arter.
tanken var att bevara den genetiska informationen om Brasiliens hotade vilda djur. En dag motiverade organisationerna att de kanske kan använda det samlade DNA: t för att klona hotade djur och stärka minskande populationer. Hittills har de två institutionerna samlat in minst 420 vävnadsprover. Nu samarbetar de på ett relaterat projekt som kommer att använda DNA i dessa prover för att förbättra avel och kloning tekniker. Nuvarande kloningstekniker har en genomsnittlig framgångsgrad på mindre än 5 procent, även när man arbetar med bekanta arter; kloning av vilda djur är vanligtvis mindre än 1 procent framgångsrik.
alla djur som är födda under Brasiliens nya åtagande kommer att bo i Brasilia Zoo, säger Embrapa-forskaren Carlos Martins. Expanderande fångenskapspopulationer av vilda djur, han och hans team hoppas, kommer att avskräcka djurparker och forskare från att ta ännu fler vilda djur ur sina inhemska livsmiljöer. Martins och hans kollegor har ännu inte bestämt vilka arter de ska försöka klona men den manade vargen och jaguaren är starka kandidater. International Union for Conservation of Nature klassificerar båda djuren som” nära hotade ”på sin röda lista över hotade arter, två nivåer under” hotade.”
många forskare är överens om att kloning för närvarande inte är en genomförbar eller effektiv bevarandestrategi. Först och främst påpekar vissa naturvårdare att kloning inte tar upp orsakerna till att många djur blir hotade i första hand—nämligen jakt och förstörelse av livsmiljöer. Även om kloning teoretiskt kan hjälpa till i verkligt desperata situationer är nuvarande kloningstekniker helt enkelt för ineffektiva för att göra stor skillnad. Jämfört med kloning av inhemska arter-särskilt nötkreatur, som framgångsrikt har klonats i flera år för att duplicera önskvärda egenskaper—är kloning av hotade arter mycket svårare av ett antal skäl.
framgångsrik kloning innefattar i allmänhet minst tre väsentliga komponenter: DNA från djuret som ska klonas; ett livskraftigt ägg för att ta emot det DNA; och en mor att gestat det resulterande embryot. Ofta behövs hundratals embryon och försök till graviditeter för att producera till och med några kloner. Forskare har vanligtvis en dålig förståelse för utrotningshotade djurs reproduktionsfysiologi, vilket gör det för riskabelt att extrahera ett tillräckligt antal ägg från den arten eller förlita sig på kvinnor av den arten för att föda kloner. Juridiska skydd utesluter ibland hotade arter från sådana förfaranden också. För att kompensera smälter forskare DNA från en hotad art med ägg från en närbesläktad art och väljer mödrar från den senare. Sådana hybridembryon misslyckas ofta med att utvecklas ordentligt.
även om de är mycket medvetna om dessa problem, tycker Martins och hans kollegor, liksom några andra forskare runt om i världen, att ansträngningar för att arkivera den genetiska informationen om utrotningshotade vilda djur är värda. Vissa forskare är fortfarande optimistiska att kloning kommer att bli ett användbart verktyg för bevarande i framtiden. Optimister pekar på de senaste framgångarna kloning av vilda däggdjur med hjälp av närbesläktade inhemska arter, förbättrade tekniker för att förebygga utvecklingsavvikelser i ett klonat embryo, bättre neonatal vård för nyfödda kloner och in vitro fertilisering möjliggjort av stamceller härledda från frusen vävnad.
de första klonerna
i början av 1950-talet klonade Robert Briggs och Thomas King framgångsrikt 27 Norra leopardgrodor genom en process som kallas kärnöverföring. Kärnan, som ofta kallas cellens kommandocenter, innehåller det mesta av ett ryggradsdjurs DNA—förutom DNA i bönformade, energigenererande organeller som heter mitokondrier. Briggs och King tömde grodaägg av sina kärnor, sugade kärnor ur celler i grodaembryon och injicerade dessa kärnor i de tomma äggen. Många av äggen utvecklades till grodyngel som var genetiskt identiska med de embryon som hade donerat deras nukleära DNA.
1958 klonade John Gurdon, då vid University of Oxford, och kollegor grodor med kärn-DNA extraherat från cellerna i fullformade tadpoles. Till skillnad från embryonala celler, som är genetiskt flexibla nog för att bli en mängd olika vävnader, är en tadpoles celler ”differentierade”—det vill säga de gener som de uttrycker har förändrats för att passa profilen för en specifik celltyp: en hud -, ögon-eller hjärtcell, till exempel. Gurdon visade att när det transplanteras i ett ägg återgår kärn-DNA från en mogen cell till det mer mångsidiga tillståndet som är karakteristiskt för DNA i ett embryos celler. Detta genombrott uppmuntrade forskare att försöka klona mycket större djur med DNA från vuxna celler.
1996 försökte forskare i Skottland klona ett kvinnligt Finn-Dorset-får. De injicerade kärnor extraherade från hennes juverceller i nästan 300 tomma ägg härrörande från skotska blackfaces, en annan fårras. Av de beredda äggen lyckades forskarna skapa mer än 30 embryon. Endast fem av dessa embryon utvecklades till lamm efter att ha implanterats i surrogat skotska blackfaces. Och bara ett av dessa lamm överlevde till vuxen ålder. Forskarna kallade henne Dolly.
sedan dess har vissa biologer upprepade gånger föreslagit att kloning kan hjälpa till att rädda hotade arter, särskilt i svåra situationer där bara några dussin eller en handfull djur kvarstår. Ju mindre, mer homogen och mer inavlad en population, desto mer mottaglig är den för en enda skadlig genetisk mutation eller sjukdom. Kloner kan teoretiskt öka den genetiska mångfalden hos en hotad befolkning om forskare har tillgång till bevarat DNA från många olika individer. Åtminstone kan kloner stabilisera en krympande befolkning. Och vissa forskare hävdar att en genetiskt homogen men stabil befolkning skulle vara bättre än utrotning; vissa mycket inavlade grupper av vilda djur, som Chillingham-nötkreatur i England, har överlevt bra i hundratals år.
en art som kan dra nytta av kloning är den norra vita noshörningen, som är infödd i Afrika. 1960 var den globala Norra vita noshörningsbefolkningen mer än 2000 starka, men tjuvjakt har minskat antalet till så få som 11 idag. Vid senaste räkningen bor tre i djurparker-två i San Diego och en i Tjeckien—fyra bor i Ol Pejeta Conservancy i Kenya och så få som fyra individer kan fortfarande leva i naturen baserat på obekräftade rapporter, men de har inte upptäckts på flera år. De flesta av de fångade djuren är ointresserade av parning eller infertila, även om två noshörningar parades sommaren 2012.
just nu är kloning osannolikt att hjälpa den vita noshörningen eller någon annan hotad art. Hittills är historien om kloning av utrotningshotade djur en av få högprofilerade framgångar och många, många misslyckanden. Sedan början av 2000-talet, med samma teknik som producerade Dolly, har forskare klonat flera hotade och till och med utdöda däggdjur, inklusive ett mouflonfår och en nötkreatur som kallas en gaur 2001; en slags vild boskap som kallas en banteng 2003; en vild get som kallas Pyrenean ibex 2009; och vilda coyoter 2012. I varje fall dog många fler kloner före födseln än överlevde; i de flesta fall överlevde ingen av klonerna till vuxen ålder.
Mismatched
alla dessa försök kloner av utrotningshotade eller utdöda djur dog på olika sätt av olika skäl, men de delade alla ett grundläggande problem—de var inte exakta kopior av sina motsvarigheter. I de flesta fall har forskare kombinerat DNA från den hotade arten med ägg från en besläktad tamart. Varje surrogatmamma implanteras ofta med dussintals hybridembryon för att uppnå åtminstone några graviditeter, en strategi som kräver att hundratals ägg extraheras. Eftersom reproduktionsfysiologin hos de flesta hotade djur är så dåligt förstådd, är forskare ofta osäkra när djuren ägglossar och hur man bäst kan förvärva sina ägg. I vissa fall hindrar juridiska skydd forskare från att skörda ägg från hotade arter. Av alla dessa skäl vänder de sig till mer kända inhemska arter istället.
att injicera DNA från en art i ägget från en annan art—till och med ett nära besläktat—skapar ett ovanligt hybridembryo som ofta inte utvecklas ordentligt i livmodern hos en surrogatmamma. Hybridembryon har kärn-DNA från den klonade arten och mitokondriellt (mtDNA) DNA från donatorägget. Denna obalans blir problematisk när embryot utvecklas. Nukleärt DNA och mtDNA arbetar tillsammans; de innehåller båda genetiska recept för proteiner med vilka celler extraherar energi från mat. I ett hybridembryo passar dessa proteiner inte alltid ihop ordentligt, vilket gör att cellerna svälter för energi. Komplicerande frågor vidare avvisar surrogatmor ofta hybridembryot eftersom hon känner igen några av embryonets vävnader, särskilt moderkakan, som främmande.
ett annat problem – och det mest otänkbara hittills—är att ett hybridembryo skapat via kärnöverföring inte är en genetisk tom skiffer som de flesta embryon. Alla ryggradsdjur börjar livet som ihåliga bollar av embryonala stamceller, som kan bli nästan vilken typ av vuxencell som helst. Var och en av dessa stamceller innehåller en kopia av exakt samma genom förpackat i kromosomer—täta buntar av DNA-och histonproteiner. När embryot utvecklas börjar stamcellerna ta på sig sina vuxna former: vissa blir hudceller, andra hjärtceller och så vidare. Olika typer av celler börjar uttrycka olika mönster av gener. Inuti varje cell interagerar ett sortiment av molekyler och enzymer med DNA och histoner för att förändra genuttryck. Vissa molekyler, såsom metylgrupper, blockerar fysiskt cellulära maskiner från att läsa de genetiska instruktionerna i vissa segment av DNA; vissa enzymer lossar bindningarna mellan histoner och DNA, vilket gör vissa gener mer tillgängliga. Så småningom har varje celltyp—hudcell, levercell, hjärncell—samma genom, men ett annat epigenom: ett unikt mönster av gener som aktivt uttrycks eller effektivt tystas. Med tiden kan en vuxen cells epigenom förändras ytterligare, beroende på djurets livserfarenheter.
så när forskare injicerar en vuxen cellkärna i ett tomt ägg, tar kärnan med sig sitt unika epigenom. Som Gurdons tidiga experiment på 1950—talet och efterföljande studier har visat, kan ett ägg radera epigenomet av infört kärn-DNA, torka skifferet rent-till viss del. Denna process av ”nukleär omprogrammering” är dåligt förstådd, och ägget misslyckas ofta med att slutföra det ordentligt, särskilt när ägget är från en Art och kärn-DNA från en annan. Ofullständig nukleär omprogrammering är en av huvudorsakerna, tror forskare, för de många utvecklingsavvikelser som dödar kloner före födseln och för de medicinska problem som är gemensamma för många överlevande, såsom extremt hög födelsevikt och organsvikt.
vissa forskare ser vägar runt dessa problem. Pasqualino Loi från University of Teramo i Italien var en del av ett team som framgångsrikt klonade hotade mouflonfår i början av 2000-talet; klonerna dog inom sex månader efter födseln. Loi och hans kollegor tror att de kan öka chanserna för att ett hybridembryo överlever i en surrogatmors livmoder. Först föreslår de att forskare kan vårda ett hybridembryo under en kort tid i labbet tills det utvecklas till det som kallas en blastocyst—den bollformade början av ett ryggradsdjur som består av en yttre cirkel av celler, trofoblasten, som omger en klump av snabbt delande stamceller som kallas den inre cellmassan. Så småningom blir trofoblasten moderkakan. Forskare kunde skopa ut den inre cellmassan från hybridblastocysten, föreslår Loi, och transplantera den till en tom trofoblast härledd från samma art som surrogatmodern. Eftersom surrogatmodern är mycket mindre benägna att avvisa en trofoblast från sin egen art, har det utvecklande embryot inom en mycket bättre chans att överleva.
forskare har också listat ut hur man uppmuntrar nukleär omprogrammering genom att bada ägget i vissa föreningar och kemikalier, såsom trichostatin A, som stimulerar eller hämmar enzymerna som bestämmer en Cells epigenom. Senast producerade Teruhiko Wakayama från RIKEN Center for Developmental Biology i Kobe, Japan och hans kollegor 581 klonade möss från en enda givarmus över 25 generationer, med trichostatin A för att uppnå framgångsnivåer så höga som 25 procent i vissa men inte alla generationer. För att lösa felaktigheten mellan mtDNA och nukleärt DNA föreslår Loi att man helt enkelt tar bort äggets infödda mtDNA och ersätter det med mtDNA från arten som ska klonas—något som forskare försökte på 1970-talet och 80-talet, men har inte försökt nyligen av orsaker som är oklara.
några av de mest framgångsrika försöken att klona utrotningshotade djur de senaste åren har involverat två av de mest älskade tamarterna-katter och hundar. Vid Audubon Center for Research of Endangered Species i New Orleans har Martha Gomez och hennes kollegor skapat många afrikanska vildkattkloner sedan mitten av 2000-talet och använt huskatter som surrogatmödrar. Gomez säger åtta kloner har överlevt till vuxen ålder hittills och är alla friska idag. Hon tillskriver sin framgång delvis till det faktum att vildkatter och huskatter är mycket närmare besläktade med varandra än de flesta vilda och inhemska arter som är parade i syfte att klona. Hon och hennes team har också lärt sig att öka andelen framgångsrika med kejsarsnitt-att skona kloner stressen av en typisk födelse – och att hålla nyfödda kloner i intensivvård för ett par veckor, som om de var för tidigt födda barn. 2008, B. C. Lee från Seoul National University i Korea och hans kollegor uppnådde liknande framgång med att använda inhemska hundar för att skapa tre friska manliga gråvargkloner. Lees team hade tidigare skapat två kvinnliga gråvargkloner. Alla fem djuren överlevde till vuxen ålder, bekräftar Lee.
Gomez arbetar med svartfotade katter, som är infödda i Afrika och listade som ”sårbara” på den röda listan, och fokuserar nu på en metod för kloning som skiljer sig från kärnöverföring. Hon försöker omvandla vuxna celler från svartfotade katter till stamceller och inducerar därefter dessa stamceller att bli spermier och ägg. Sedan, genom in vitro fertilisering eller liknande tekniker, kunde hon impregnera huskatter med svartfotade kattembryon. Alternativt kan stamceller härledda spermier och ägg användas för att impregnera kvinnor av de hotade arterna.
att säga att detta tillvägagångssätt är tekniskt utmanande skulle vara en underdrift, men forskare har gjort imponerande framsteg. 2011 Jeanne Loring från Scripps Research Institute i La Jolla, Kalifornien. och hennes kollegor producerade stamceller från de frusna hudcellerna av två hotade arter—den norra vita noshörningen och en baboonlike primat som kallas en borr. Och 2012 Katsuhiko Hayashi från Kyoto University Graduate School of Medicine och kollegor förvandlade hudceller från vuxna möss till stamceller, som de sedan förvandlade till livskraftiga ägg. Efter att ha befruktat äggen med spermier i provrör implanterade forskarna embryona i surrogatmammus som födde friska och bördiga avkommor.
” jag säger inte att kloning kommer att rädda hotade arter”, säger Gomez, ” men jag tror fortfarande på kloning som ett annat verktyg. Det är dock inte lätt. Forskningen går långsamt.”
Teramos Loi förblir också optimistisk. Han anser att forskare bör fortsätta att samla in och bevara den genetiska informationen om hotade djur, som Brasilien har gjort, vilket skapar biobanker av vävnad på is, till exempel ”frozen zoo” vid San Diego Zoo ’ s Institute for Conservation Research. Om forskare lyckas dramatiskt öka effektiviteten vid kloning av vilda och utrotningshotade djur—oavsett om det är kärnöverföring eller in vitro—befruktning-kommer det DNA de behöver att vänta på dem. Om de inte gör det kommer biobanker fortfarande att vara användbara för mer grundläggande forskning. ”När kloning av utrotningshotade djur är korrekt etablerad kommer det att vara ett mycket kraftfullt verktyg”, säger Loi. ”Om något kan göras kommer det att göras om 10 år.”