Claudin 1 i Brösttumörgenes: uppenbarelse av en möjlig Roman ”Claudin High” delmängd av bröstcancer

Abstrakt

Claudins är huvudkomponenten i de täta korsningarna i epitelceller och spelar som sådan en nyckelroll i den polariserade placeringen av jonkanaler, receptorer och enzymer till de olika membrandomänerna. I det avseendet är claudiner nödvändiga för en harmonisk utveckling av ett funktionellt epitel. Dessutom har defekta täta korsningar associerats med utvecklingen av neoplastisk fenotyp i epitelceller. Nedbrytning av cell-cell-interaktioner och avreglering av uttrycket av korsningsproteiner tros därför vara viktiga steg i invasion och metastas. Flera studier tyder på att claudins är stora deltagare i brösttumörgenes. I detta dokument diskuterar vi de senaste framstegen i vår förståelse av claudin 1: s potentiella roll i bröstcancer. Vi diskuterar också betydelsen av en delmängd av östrogenreceptornegativa bröstcancer som uttrycker ”höga” nivåer av claudin 1-proteinet. Vi föreslår att claudin 1 fungerar både som en tumörsuppressor såväl som en tumörförstärkare/facilitator vid bröstcancer.

1. Bröstcancer

bröstcancer är fortfarande en av de vanligaste diagnosen cancer bland kvinnor i Nordamerika . Baserat på molekylära, epidemiologiska och histologiska observationer har en morfologisk progressionsmodell för bröstcancer samlats under det senaste decenniet . Denna föreslagna modell (figur 1) skisserar ett kontinuum av lesioner som beskriver en stegvis progression av bröstcancer, från epitelial hyperplasi, genom atypisk hyperplasi och duktalt karcinom in situ, till invasivt karcinom och så småningom metastatisk sjukdom . Trots många framsteg inom diagnos och behandling av bröstcancer är metastaser fortfarande en oöverstiglig utmaning. Cirka 40% av kvinnorna misslyckas för närvarande primära hanteringsstrategier för tidig bröstcancer och slutligen ge efter för sjukdomen.

Figur 1

hypotetisk modell av brösttumörgenes och progression. Den stegvisa progressionen av bröstcancer beskrivs som ett kontinuum av lesioner från epitelial hyperplasi till invasivt karcinom och så småningom metastasering.

sjukdomspresentationens komplexa natur och begränsningarna i att identifiera kliniskt relevanta delmängder av patienter skapar stora svårigheter för nuvarande diagnostiska och terapeutiska strategier för bröstcancer. En växande förståelse för den heterogena naturen hos denna sjukdom har främst härrört från cDNA-mikroarray och immunhistokemiska studier, vilket har lett till en omdefiniering av bröstcancerundergrupper . Hittills har 5 distinkta bröstcancerkategorier identifierats (Tabell 1 ) baserat på ER/PR-status, Her2, CK5/6 och EGFR-uttryck. Terapeutiskt har dessa subtyper visat sig visa en mängd olika svar på olika behandlingar . Den luminala a-subtypen (Tabell 1), som är känsligare för hormoner, har det mest gynnsamma resultatet medan Her2 och de basala subtyperna, som inte är känsliga för hormoner, är mer aggressiva, visar den värsta prognosen och har färre terapeutiska alternativ . Uppenbarligen kommer den ytterligare identifieringen av olika subtyper av bröstcancer att ge mer terapeutiska möjligheter att matcha egenskaperna hos enskilda bröstcancerpatienter, vilket förbättrar vår förmåga att börja erbjuda individualiserad behandling till patienter.

två hypotetiska modeller har föreslagits för att förklara utvecklingen av bröstcancerundertyper . I den första modellen, den linjära modellen, är ursprungscellen densamma för olika tumörsubtyper (och sålunda bestäms tumörsubtypen av förvärvade genetiska och epigenetiska händelser). I den andra modellen, den olinjära modellen, är ursprungscellen annorlunda (förmodligen en stamcell eller en stamcell) för de olika subtyperna. Senaste arbete av Jeselsohn et al. har lämnat bevis som tyder på att det finns två populationer av stamceller, en som ger upphov till luminal-liknande bröstcancer och den andra till de basala-liknande bröstcancer.

2. Epithelial mesenkymal övergång (EMT)

förvärvet av den invasiva fenotypen tros markera den mest signifikanta förändringen i bröstcancerbiologi eftersom den representerar det första steget mot utveckling av metastatisk sjukdom. När celler omvandlas från den icke-invasiva till den invasiva fenotypen blir de förankringsoberoende och uppvisar förbättrad motilitet samt ökad aggressivitet, en process som kallas epithelial-mesenkymal övergång (EMT).

under denna övergång förvärvar epitelceller en mesenkymliknande fenotyp via störning av intercellulär vidhäftning och förbättrad motilitet (för granskning se ). Man tror att celler växlar från ett keratin (epitel) rikt nätverk till ett vimentin (mesenkymalt) rikt nätverk för att underlätta deras rörlighet . När det gäller mesenkymala celler, i motsats till epitelceller, kan de individuellt migrera, tränga in i omgivande vävnader och sprida sig till avlägsna platser . Nedbrytningen av cell-cell-interaktioner och det avreglerade uttrycket av de korsande proteinerna tros därför vara viktiga steg i invasion och metastas .

3. Täta korsningar

täta korsningar är de mest apikala av intercellulära korsningar och visas som ett nätverk av kontinuerliga och anastomoserande filament på plasmamembranets protoplasmiska yta (Figur 2). De bidrar till den transepiteliala barriären som styr transporten av joner och små molekyler genom den paracellulära vägen, en egenskap som kallas ”barriärfunktionen”. Täta korsningar är också avgörande för organisationen av epitelcellpolaritet, som separerar plasmamembranet i apikala och basolaterala domäner . De är också kritiska för den polariserade placeringen av jonkanaler, receptorer och enzymer till membrandomänerna som är nödvändiga för strukturellt och funktionellt utvecklad epitel, en funktion som kallas ”staket” – funktionen . Täta korsningar är därför nödvändiga för tät tätning av cellulära ark och upprätthållande av homeostas . Bortsett från att upprätthålla cellpolaritet och paracellulära funktioner är täta korsningsproteiner involverade i rekrytering av signalproteiner . Primärt utgör tre typer av integrerade membranproteiner de täta korsningarna(Figur 2); claudins, occludin och junctional adhesion molecule (s), med claudins och occludin som de två huvudmolekylära komponenterna för att bilda den täta korsningssträngen. Den junctional adhesion molecule tros fungera som den initiala rumsliga cue för tight junction bildning . I samband med adheren-föreningsproteinerna, som är ansvariga för den mekaniska vidhäftningen mellan intilliggande celler och stabiliseringen av hela multicellulära arkitekturen, utgör de det apikala föreningskomplexet i epitelvävnad .

Figur 2

Snäva Korsningar. Täta korsningar är de mest apikala intercellulära korsningarna i epitelceller. De viktigaste molekylära komponenterna i de täta korsningarna är claudins, occludin och junctional adhesion molecule (JAM). Täta korsningsproteiner i samband med adheren-korsningsproteiner (cadheriner, cateniner) bildar epitelcellskorsningsanläggningar . Gap-korsningen är belägen basal till adheren-korsningen.

4. Täta Korsningsproteiner och Tumörgenes

en stark koppling mellan täta korsningsproteiner och cancerutveckling har etablerats. Förändringar i strukturen och funktionen hos täta korsningar har faktiskt rapporterats i adenokarcinom i olika organ . En frånvaro av snäva korsningar eller defekta täta korsningar har också associerats med utvecklingen av den neoplastiska fenotypen i epitelceller . Sådana observationer överensstämmer med den accepterade tanken att störningen av snäva korsningar leder till förlust av sammanhållning, invasivitet och brist på differentiering, vilket främjar tumörgenes. För närvarande har mest kunskap om rollen av junctional proteiner i cancer, och mer specifikt bröstcancer, härrörde från studier på det stora adheren junction-proteinet, E cadherin (för granskning se ). Nedreguleringen av E cadherin tros vara en viktig molekylär händelse under epitel-mesenkymal övergång . I motsats till E cadherin är rollen för de täta korsningsproteinerna inte väl förstådd i bröstcancer.

4.1. Claudinerna

claudinerna är huvudkomponenten i den snäva korsningen, och 24 medlemmar av denna familj av proteiner har identifierats hittills . De är små proteiner som sträcker sig i storlek från 22 till 27 kD och kodas av minst 17 humana gener (Tabell 2), belägna på 12 olika kromosomer . Fördelningen av loci för claudin-generna bland så många olika kromosomer är intressant eftersom i allmänhet många genfamiljer har de flesta, om inte alla deras medlemmar belägna på en kromosom . Den breda fördelningen kan återspegla de multifunktionella egenskaperna hos dessa proteiner. Tre claudin-genkluster är lätt uppenbara på kromosom 3 (3q28), 4 (4q35.1) och 7 (7q11 .23) och det är mycket troligt att medlemmar inom dessa kluster kan ha liknande funktion och vävnadsspecificitet. Bortsett från dessa tre claudin-genkluster verkar det inte finnas något annat uppenbart mönster (Tabell 2). Det är möjligt att utvidgningen av claudin-genfamiljen hos människor kan ha möjliggjort förvärv av nya funktioner under evolutionen, vilket postuleras för denna genfamilj i teleostfisk . Claudinerna delar en gemensam transmembrantopologi; varje familjemedlem förutspås ha fyra transmembrandomäner med intracellulär amino-och karboxyltermini i cytoplasman och två extracellulära slingor . Uttrycksmönstret för claudin-proteinerna är vävnadsspecifikt ; de flesta vävnader uttrycker emellertid flera claudiner som kan interagera på antingen ett homotypiskt eller heterotypiskt sätt för att bilda den snäva korsningssträngen . Den exakta kombinationen av claudin-proteinerna i en given vävnad bestämmer selektiviteten, styrkan och tätheten hos den täta korsningen .

hittills har endast ett fåtal studier tagit upp claudins roll i bröstcancer och fynd om deras funktion är fortfarande kontroversiella . I flera cancerformer, inklusive bröstcancer, har förändrat proteinuttryck hos vissa claudin – familjemedlemmar visats (för granskning se ). Till exempel har proteinuttryck av claudin 3 och 4 visat sig vara uppreglerat vid invasiv bröstcancer medan, även vid invasiv bröstcancer, uttrycket av claudin 1 och 7 proteiner nedreglerades .

4.2. Claudin 1

Knockout-mössexperiment har visat att det täta korsningsproteinet claudin 1, och inte occludin, bildar ryggraden i den täta korsningssträngen och är avgörande för epidermal barriärfunktion . Uttryck av claudin 1 har undersökts i ett antal cancerformer (för granskning se ). Både en ökning och en minskning av claudin 1-proteinuttryck har visat sig vara associerade med tumörgenes. I vissa cancerformer, inklusive prostata , bröst och melanocytisk neoplasi , har förlust av claudin 1 associerats med cancerprogression och invasion och förvärvet av den metastatiska fenotypen. I esophageal skivepitelcancer minskade uttrycket av claudin 1 korrelerat med återfall och kortare sjukdomsfri överlevnad, medan i lungcancer, claudin 1 visade sig undertrycka uttrycket av invasion/metastas förstärkare och öka uttrycket av cancer invasion/metastas suppressorer, vilket ger stödjande bevis för att föreslå att det fungerar som en cancer invasion/metastas suppressor . Omvänt, i andra cancerformer , såsom papillär sköldkörtel oral skivepitelcancer , äggstockscancer , kolon , melanom och gastrisk , överuttryck av claudin 1 har associerats med aggressivitet och den ökade maligna fenotypen. Vidare har funktionella studier visat att claudin 1 kan rekrytera och främja aktiveringen av metalloproteinas MMP-2 och leda till en mer aggressiv fenotyp vid oral och äggstockscancer.

5. Claudin 1 Vid Normal bröst-och bröstcancer

i normal bröstkörtel har täta korsningsproteiner huvudsakligen undersökts i förhållande till laktogenes . Tidigare arbete från vårt laboratorium har identifierat claudin 1 som en mycket uppreglerad gen under tidig bröstkörtelinvolution , och dess uttryck visade sig vara tätt reglerat under olika stadier av normal utveckling av muskörteln . Nyligen har det varit ett ökat intresse för claudin 1: s potentiella roll i bröstcancer. Även om studier fortfarande är relativt begränsade finns det några kritiska rapporter som visar en tydlig koppling mellan claudin 1-uttryck och bröstcancerprogression. Majoriteten av studierna pekar på en nedreglering eller fullständig förlust av claudin 1-uttryck i maligna invasiva humana bröstcancer och i vissa humana bröstcancercellinjer . En korrelation mellan claudin 1 nedreglering och sjukdomsåterfall rapporterades också nyligen . Dessutom, funktionella studier tyder också på att claudin 1 kan vara en nyckelaktör i brösttumörgenes. En nedreglering av claudin 1-genuttryck visade sig leda till neoplastisk transformation av bröstepitelceller . Även omuttrycket av claudin 1 ensam visade sig vara tillräckligt för att inducera apoptos i en human bröstcancercellinje . Det har också föreslagits att claudin 1 ensam kan vara tillräcklig för att utöva en tät korsningsmedierad grindfunktion i metastatiska tumörceller även i frånvaro av andra täta korsningsassocierade proteiner . Dessutom har subcellulär lokalisering av claudin 1 visats (av oss och andra ) att störas i invasiv bröstcancer vilket leder till en detektering av detta protein i cytoplasman. Intressant har en koppling mellan claudin 1 och epithelial mesenkymal övergång nyligen etablerats. Som med E cadherin transkriptionsfaktorerna, snigel och snigel, nyckelmarkörer för epitelial mesenkymal övergång, visades binda till claudin 1-promotorn vilket resulterade i undertryckandet av dess aktivering .

ytterligare arbete från vårt laboratorium har också visat att claudin 1-uttryck i bröstcancer är ännu mer komplex än vad som ursprungligen trodde. Med hjälp av vävnadsmikroarraystrategier visade vi att i en kohort av mänskliga invasiva bröstcancer som uppvisar blandade patologiska lesioner (340 biopsier, den största undersökta hittills), uttrycker endast en liten andel tumörer claudin 1-protein. Frekvensen av claudin 1-positiva tumörer var signifikant lägre än frekvensen av tumörer som observerades som positiva för claudin 3 och 4, två familjemedlemmar som tidigare visat sig vara överuttryckta i invasiv human bröstcancer .

eftersom er-status ofta anses vara en viktig klassificerare av bröstcancer (Tabell 1), ville vi avgöra om det fanns någon koppling mellan östrogen/östrogenreceptor och claudin 1. Vi visade att i ERve bröstcancer (189 biopsier) var ett signifikant litet antal tumörer (5%) positiva för claudin 1-uttryck, medan i ERve-tumörerna (151 biopsier) var frekvensen av positiv tumörfärgning för claudin 1 signifikant högre (39%). En positiv förening hittades också med EGFR, en markör för dålig prognos. Överraskande hittades också en signifikant korrelation med claudin 1 och markörer av den basaliknande subtypen av bröstcancer , en aggressiv subtyp av bröstcancer associerad med den värsta prognosen och minskad patientöverlevnad. Vi visade också för första gången att i den östrogenreceptorpositiva (ERve) humana cellinjen, MCF7, att claudin 1-uttrycket reglerades ned av östrogen in vitro (opublicerade data).

6. Är Claudin 1 mycket mer än en tumörsuppressor i Brösttumörgenes?

både ett över-och ett underuttryck av claudin 1 har observerats i olika typer av cancer , som beskriver komplexiteten i dess potentiella roll i karcinogenes. I bröstcancer, majoriteten av studier som hittills publicerats, men begränsade i antal, visar att partiell eller total förlust av claudin 1-uttryck korrelerar med ökad malign potential och invasivitet och med återkommande sjukdom . Också, återuttrycket av claudin 1 i bröstcancerceller visades inducera apoptos . Dessutom visade våra vävnadsmikroarraystudier att en signifikant låg frekvens av humana invasiva bröstcancer var positiv för claudin 1-uttryck . Sammantaget ger dessa studier stödjande bevis som tyder på att claudin 1 fungerar som en tumörsuppressor vid brösttumörgenes.

paradoxalt nog har vårt laboratorium också lämnat bevis som tyder på att claudin 1: s roll i bröstcancer kan vara mycket mer än en tumörsuppressor. Vi visade i våra TMA-studier att frekvensen av claudin 1-positiva tumörer var signifikant högre i ERve bröstcancer än i ERve bröstcancer . Så vitt vi vet är dessa studier den första rapporten för att ta itu med claudin 1-uttryck i bröstcancer i samband med ER-status. Vi visade vidare att claudin 1-positivitet (liksom claudin 4) var signifikant associerad med den basaliknande subtypen av bröstcancer, en av de mest aggressiva subtyperna . Observera, i en nyligen genomförd studie av Kulka et al., 2008, visades det att claudin 4-uttrycket var signifikant högre i den basaliknande subtypen av bröstcancer . Eftersom claudin 1 allmänt anses vara en ”tumörsuppressor” vid bröstcancer var våra observationer oväntade. Hur kan sådana observationer rationaliseras? Det finns några möjliga scenarier som kan förklara dessa resultat. För det första är det troligt att inte alla tumörceller förlorar claudin 1-uttryck under tumörgenes. I linje med den föreslagna olinjära modellen av bröstcancersubtyper är det möjligt att cellerna som behåller claudin 1-uttryck är de celler som redan är förutbestämda för att fungera basaliknande bröstcancer. Sedan, i dessa celler, kan claudin 1: s roll vara en tumörpromotor snarare än en tumörsuppressor. Å andra idan, om man betraktar den linjära modellen av bröstcancerundertyper , tros tumörceller fortskrida från tjän ter till tjän ter när cancern går framåt. Då tillskrivs den ökade frekvensen av claudin 1 positiva tumörer i ERve-kohorten ett återuttryck av claudin 1 i dessa tumörer? Ett sådant koncept stöds av det signifikant högre uttrycket av claudin 1-färgning (en indikator på proteinuttryck) som observerades i ERve-tumörerna. Här elimineras tumörsuppressorfunktionen hos den återuttryckta claudin 1 och ersätts nu av en tumörförbättrande funktion, vilket underlättar brösttumörgenes. Detta återuttryck av claudin 1 kan tillskrivas ett antal förmildrande faktorer inklusive genetisk mutation i claudin 1-genen eller epigenetisk modifiering av proteinet. Sekvensanalysstudier av den kodande regionen av claudin 1 hos både sporadiska och ärftliga bröstpatienter misslyckades dock med att identifiera någon signifikant mutation som kan vara ansvarig för att förändra claudin 1-genuttrycket i brösttumörer. En intressant möjlighet är att den högre nivån av claudin 1-proteinet kan bero på en defekt interagerande partner som resulterar i oförmågan hos claudin 1 att transporteras tillbaka till membranet där det kan fly längre ner reglering av andra faktorer och därför leda till en ackumulering av claudin 1 i cytoplasman. Det senare har nyligen visats för E cadherin . Vidare tros den exakta kombinationen av claudin-proteiner i en given vävnad bestämma styrkan hos den täta korsningen . Således kan en av konsekvenserna av denna avvikande ackumulering av claudin 1 i de ERve invasiva bröstcancer vara en omdefiniering av sminken i den täta korsningen, vilket ytterligare undergräver korsningsintegriteten och därigenom underlättar Tumörprogression ytterligare. Sammantaget verkar det som om claudin 1s Roll sträcker sig utöver en tumörsuppressor. Vi skulle vilja föreslå att claudin 1 fungerar både som en tumörsuppressor och en tumörförstärkare/facilitator vid bröstcancer. Vi föreslår vidare att dess tumörlättande roll är särskilt associerad med de erva bröstcancersubtyperna (Figur 3).

Figur 3

en hypotetisk modell av claudin 1-uttryck i olika bröstcancerundertyper. Denna modell föreslår att claudin 1 är en tumörsuppressor i ER+ve-subtyperna av bröstcancer (luminal A och B) och en tumörförstärkare/facilitator i er-undertyperna av er-typen (basaliknande, HER2 överuttryckande, normalliknande). Medan en signifikant koppling mellan claudin 1 och den basaliknande subtypen har visats, är detta ännu inte bestämt för Her2 överuttryck och de normalliknande subtyperna.

nyligen har en” claudin low ” subtyp av bröstcancer identifierat om primärt ERve och uppvisade lågt uttryck av claudin 3, 4 och 7 . Vi skulle vidare vilja föreslå en” claudin high ” subtyp som är ER–ve och som uppvisar ett högt uttryck av claudin 1-protein (och claudin 4). Denna subtyp skulle inkludera basaliknande bröstcancer och utesluta de ERve luminala subtyperna. Den kliniska signifikansen av ett högt uttryck av claudin 1-proteinet i ERve bröstcancer och dess associering med den basaliknande subtypen kan identifiera dess potentiella användning som en diagnostisk och prognostisk indikator för en viss bröstcancerundergrupp.

7. Framtida perspektiv

Monteringsbevis tyder på att claudin 1 har en unik roll i bröstcancer och bröstcancerprogression. Eftersom claudin 1 är ett transmembranprotein med två stora extracellulära slingor är det en potentiellt attraktiv kandidat för användning i terapeutiska strategier. När vi börjar ta itu med claudin 1s roll i bröstcancerprogression sitter vi kvar med många obesvarade frågor. Vad är uttrycksnivån för claudin 1-proteinet i olika histologiska subtyper av bröstcancer? Vad utlöser dess reglering och får claudin 1 att byta roll i olika stadier av bröstcancerprogression? Varför ackumuleras claudin 1 i cytoplasman? Finns det en mutation i claudin-genen eller proteinet i den basaliknande subtypen av bröstcancer? Fungerar claudin 1 i samförstånd med andra claudins eller junctional proteiner som E cadherin? Finns det korssamtal med östrogenreceptorvägen? Det är uppenbart att mer detaljerade funktionella analysstudier är motiverade både in vitro och in vivo.

man kan bara förutsäga att fler bröstcancerundertyper kommer att identifieras inom en snar framtid och en tydligare förståelse för de cellulära och molekylära förändringar som inträffar under brösttumörgenes kommer att vara avgörande för att underlätta effektivare patienthantering och direkt påverka minskad dödlighet. Endast genom sådan förståelse kommer nya biomarkörer att identifieras som kommer att rapportera om metastatiska förändringar, bröstcancerprogression och fungera som terapeutiska mål som i slutändan leder till specifik och individualiserad patienthantering.

bekräftelse

författarna erkänner tacksamt finansiering för detta arbete som tillhandahölls av Manitoba Medical Services Foundation, Paul Thorlakson Foundation och Canadian Breast Cancer Foundation.