US Food, Drug and Cosmetic Act från 1938 krävde att tillverkare och läkemedelsföretag skulle vara ansvariga för säkerheten för läkemedelstillsatser / hjälpämnen i sina produkter som svar på en tragedi där 100 barn dödades från närvaron av dietylenglykol i en antibakteriell produkt. För att klargöra vad som behövs för att upprätta ett nytt hjälpämne släppte FDA 2005 ett vägledningsdokument med titeln ’Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical hjälpämnen’, som beskriver de säkerhetsstudier som behövs för att få ett hjälpämne godkänt1,2. Nya artiklar har krävt behovet av fler alternativa hjälpämnen för användning i formuleringar1,3,4. Formulerare föredrar i allmänhet prejudikerade hjälpämnen på grund av deras väletablerade säkerhetsprofil samt de risker och kostnader som är förknippade med godkännande av ett nytt hjälpämnen3. Vid kvalificering av ett nytt hjälpämne måste säkerhetsstudier utföras och i händelse av en biverkning finns det tvivel om huruvida biverkningen berodde på hjälpämnet eller produkten. Vid användning av ett hjälpämne, medan tidigare erfarenhet av någon injicerbar administreringsväg är värdefull för att motivera dess användning, är det värt att notera att enligt gällande bestämmelser kan förändring av administreringsvägen eller ökning av koncentrationen utöver den nuvarande högsta dosen kräva ytterligare säkerhetsdata1,2. Behovet av nya hjälpämnen är välkänt, men att utöka vår kunskap om användningen av mindre använda hjälpämnen är lika viktigt samtidigt som vi erbjuder en enklare regleringsväg framåt.
att bestämma det korrekta pH – och buffertsystemet är utan tvekan det mest kritiska steget i att formulera ett protein för att säkerställa dess löslighet och stabilitet (kemisk och fysisk)3,5-7. Artikeln kommer att fokusera på stabilisering av bioterapeutika. Buffertar som finns i både små molekyler och proteinparenterala formuleringar godkända av FDA kommer att refereras som motivering för att utforska stabiliserande effekter av dessa buffertar på proteiner. Tabell 1 visar antalet unika formuleringar som hittades genom att söka på etiketterna för produkter som godkänts av FDA. Identiska formuleringar som härrör från formuleringen av generiska produkter eller olika dosstyrkor utesluts. Närhelst buffertens saltform antyds bör bufferten antas titreras med natriumhydroxid eller saltsyra eftersom dessa är de vanligaste titranterna.
de vanligaste buffertarna som visat sig användas i parenterala formuleringar har varit citrat, fosfat och acetat. Några av styrkorna och svagheterna i samband med dessa hjälpämnen kommer att belysas. Målet med detta dokument är att uppmärksamma andra godkända men mindre vanliga buffertmedel som kräver mer omfattande användning för att bli allmänt accepterade. Även om denna artikel uteslutande kommer att fokusera på buffertar, sträcker sig samma argument till andra typer av hjälpämnen. I takt med att biotekniken utvecklas som industri och fler unika proteinställningar utvecklas blir det allt viktigare att hitta nya sätt att stabilisera dessa proteiner. Ibland är de vanligaste hjälpämnena inte tillräckliga för att ge tillräcklig stabilitet eller möjliggöra läkemedelsleveransteknik.
branschexperter från AbbVie, Vectura och Bayer diskuterar bästa praxis och deras erfarenheter av digital transformation i vårt senaste rundabordssamtal
titta på vår entimmessession om ’Upptäck potentialen i ditt lab-upptäck hur digital transformation kan vara så mycket mer än bara insikter’ där vår panel utforskar hur digital transformation kan hjälpa till att påskynda beslutsfattandet, optimera processer och ta bort operativ ineffektivitet. Du kommer att få en förståelse för hur implementeringen av en datahanteringslösning har hjälpt organisationer att implementera nya metoder och omvandla arbetsflödesprocesser
titta nu
vanliga buffertar
natriumfosfat
natriumfosfat (pKa 2.1, 7.2 och 12.3) är den vanligaste bufferten som finns i parenterala formuleringar (Tabell 1). Den mest anmärkningsvärda begränsningen vid användning av fosfat som buffert är effekten av frysning på förändringar i pH. förändringen i pH under frysning har studerats i stor utsträckning. PH-skiftet tillskrivs den selektiva kristalliseringen av det dibasiska saltet. Kristallisering kan påverkas av frysningshastigheten, start-pH och närvaron av andra kosoluter. En förändring i pH på ungefär två enheter är ganska typisk under frysning, men förändringar i pH upp till 3,6 enheter har rapporterats8-10. Den förändrade pH-miljön har potential att destabilisera protein under bearbetning av läkemedelssubstans i bulk eller lyofilisering av läkemedelsproduktlösningar11-17. Detta gäller mest under förhållanden där höga fosfatkoncentrationer används eller andra kristalliserande hjälpämnen är närvarande eftersom dessa tillstånd bidrar till att inducera fosfatkristallisering. Lösningar som innehåller höga koncentrationer av protein eller icke-kristalliserbara lösta ämnen (t.ex. sackaros) hämmar fosfatkristallisering och minimerar pH-förändringar.
citronsyra
citronsyra är en av de vanligaste buffertarna (Tabell 1). Det är en trivalent buffert som innehåller tre karboxylsyror med pKa på 3.1, 4.8 och 6.4 (Tabell 2) som erbjuder ett brett buffertområde5. Enligt FDA: s inaktiva Ingrediensdatabas finns citrat i över 100 godkända injicerbara produkter, vilket ger den en stor historia av användning och bevisar dess säkerhet.
studier som jämför subkutana injektioner av citratbuffrade formuleringar mot com-liknelseformuleringar buffrade med fosfat eller histidin har emellertid visat att citratbuffrade lösningar inducerade mer smärta vid subkutan injektion18-20. Även om denna smärta var relativt kort varaktighet (mindre än två minuter), väcker det oro för patientens efterlevnad av självadministrerande injektioner innehållande citrat18. Vid formulering med citronsyra bör målproduktprofilen och den avsedda administreringsvägen noteras. När frekventa subkutana injektioner är avsedda kan ett annat buffertmedel vara mer lämpligt.
ättiksyra
ättiksyra har en pKa på cirka 4,8 och erbjuder ett buffringsområde på 3,7-5,6 (Tabell 2). Användningen av ättiksyra är idealisk för formulering av proteiner stabila i flytande tillstånd under sura betingelser. Lyofiliseringen av ättiksyralösningar åtföljs av en ökning av pH på grund av sublimering av buffertens flyktiga syraform och lämnar bassaltet bakom sig. Detta är potentiellt destabiliserande för proteinet och försvårar kontrollen av pH i de frystorkade läkemedelsprodukterna.
ytterligare godkända buffertar
trometamin
trometamin (Tris) (pKa 8.1) har liknande egenskaper som fosfat (pKa 7.2) och kan användas som ersättning nära neutrala pH-förhållanden. Båda buffertarna uppvisar en pH-förändring under frysning. Under identiska förhållanden var pH-förskjutningen för trometamin (+2,1) ungefär lika med fosfat ( 1,8), men i motsatt riktning (Tabell 2)8.
att välja en buffert över en annan skulle då sannolikt vara beroende av känsligheten hos det enskilda proteinet till pH-skiftets riktning och eventuella specifika proteinbuffertinteraktioner. Trometamin och histidin har visat sig vara bättre stabilisatorer än fosfat när erytropoietin utsattes för hög temperaturspänning, vilket förhindrade aggregering genom att hjälpa reversibiliteten att utveckla sig21. Ure2p visade sig vara mer stabil mot fibrilbildning när den formulerades i trometamin kontra fosfat22.
histidin
histidin, en essentiell aminosyra, blir allt vanligare i formuleringar av proteinterapi. Med en pKa på 6,1 är den idealisk för proteinformuleringarna nära neutrala förhållanden (Tabell 2).
histidin har visats skydda en monoklonal antikropp i både flytande och frystorkat tillstånd mot värmestress23-25. Studier som undersökte stabiliteten hos interferon-tau visade att formuleringar innehållande histidin (följt av Tris sedan fosfat) var de mest stabila mot värmeinducerad aggregering. Denna stabilisering tillskrevs direkt bindning av histidin till proteinet26. Under lyofilisering har histidin och asparaginsyra visat sig skydda antikroppar genom att fungera som en vätebindningsdonator för att bevara intramolekylära 24-25. Dessutom har histidin visat sig ha egenskaperna hos en antioxidant på grund av dess förmåga att binda järnjoner och singlet oxygen24,27. Nackdelen med att använda histidin är att histidinlösningar har observerats ändra färg under accelererade temperaturer och surt pH samt extrahera järn från rostfritt stål24.
glukonsyra, mjölksyra och vinsyra
glukonsyra, mjölksyra och vinsyra är hjälpämnen som nästan uteslutande har använts i små molekylformuleringar. Kalciumglukonat har licensierats för behandling av vätefluoridbrännskador genom en topisk applicering. I mer allvarliga fall har en infusion av en fyra procent kalciumglukonatlösning i saltlösning använts för att förebygga vävnadsskador28. Av de 23 kommersiellt tillgängliga injicerbara formuleringarna innehållande mjölksyra som finns i FDA inaktiva Ingrediensdatabasen används fyra formuleringar för biologiska läkemedel – två peptider och två proteiner. Av de 12 formuleringarna innehållande vinsyra har endast en använts vid formulering av ett protein. Dessa buffertar kan vara lämpliga substitut för acetat och citrat.
glukonsyra är en förening som naturligt bildas från glukosoxidation. Det är en intressant förening eftersom den har potential att fungera som en buffert, stabilisator och kelatbildare på grund av att den har en struktur innehållande karboxylsyror och hydroxylgrupper.
tartarat har visat sig förbättra retentionen av monomer över citrat i en antikroppsberedning vid pH 4,0-4,5 när den lagras som en vätska vid 25 kcal C29. Det har antagits att hydroxylgrupperna i tartarat, citrat, malat och i förlängningen laktat och glukonat skulle kunna ge stabiliserande vätebindningar i den amorfa fasen av en frystorkad kaka30-31.
asparaginsyra och glutaminsyra
både asparaginsyra och glutaminsyra finns i infusioner som ges till spädbarn och barn med otillräckliga plasmakoncentrationer av aminosyror. I trophamine macai infunderas aspartat och glutamat i koncentrationer av 22 mm och 34 mM, respektivt32. Dessa koncentrationer är tillräckligt höga för att ge adekvat buffring av proteinformuleringar.
glutaminsyra när den formuleras med lika stora mängder arginin har visat sig förbättra stabiliteten och lösligheten hos intracellulära proteiner23,33 samt förhindra aggregering under rekonstitution23,34-35. Studier på insulin och humant serumalbumin indikerar att tillsatsen av glutamat och aspartat kunde hämma bildandet av aggregat36-38. Studier med pegfilgrastim visade att stabiliteten hos pegfilgrastim formulerat i glutamat eller formiat var jämförbar med acetat 39.
Citronsyracykelintermediärer
Citrat, fumarat, bronkialketoglutarat, malat och succinat är alla mellanprodukter i citronsyracykeln som befunnits vara säkra och effektiva som buffertar eller motjoner i injicerbara formuleringar. Fumarat, sackaros-ketoglutarat, malat och succinat har använts i ett begränsat antal produkter (Tabell 1). Det är självklart att de andra mellanprodukterna i Krebs-cykeln också kan vara lämpliga för användning i parenteraler. Dessa föreningar innefattar akonitat, isocitrat och oxaloacetat. Att vara divalenta och trivalenta karboxylsyror har de pKa som sträcker sig från 2,0 till 6,4, vilket gör dessa föreningar lämpliga för ett brett spektrum av formuleringar (Tabell 2).
på grund av den begränsade användningen av dessa föreningar som buffertar är det oklart om samma smärta vid injektion associerad med subkutana injektioner av citrat skulle associeras med dessa föreningar. Det finns emellertid andra fördelar med deras användning. Citrat har visat sig inducera gelering av antikroppslösningar när proteinkoncentrationen var över 100 mg/mL. Detta hänfördes till buffertens trivalenta natur. Succinat, som endast hade två karboxylsyror, visade sig inte ha samma effekt vid samma pH40.
slutsats
att bestämma rätt pH-och buffertsystem är avgörande för att få bioterapeutika till kliniken och till marknaden. Behovet av nya hjälpämnen samt en bättre förståelse av befintliga hjälpämnen är mycket önskvärt. Histidin, trometamin och ett antal andra alternativa buffertar erbjuder fördelar jämfört med konventionellt använda hjälpämnen. Användningen av dessa alternativa buffertar kan inte göra annat än att hjälpa till att öka de verktyg som formulerare har och kan möjliggöra utveckling av en terapeutisk som annars kan ha misslyckats. För att stabilisera det stora antalet proteinbehandlingar under utveckling bör alla tillvägagångssätt vara öppna för övervägande.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, tj (2011) trender i Hjälpämnets säkerhetsutvärdering. Int. J. Tox. 30, 600-610
2. FDA (2005) vägledning för industrin: icke-kliniska studier för säkerhetsutvärdering av farmaceutiska hjälpämnen
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) buffertar: principer och praxis. Metoder inom enzymologi. 182, 24-38
6. Trevino, Sr, Scholtz, JM, Pace, CN (2008) mätning och ökande Proteinlöslighet. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010) proteinaggregation-vägar och påverkande faktorer. Int. J. Farmaci. 390, 89–99
8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) minimera aggregeringen av neutrala Insulinlösningar. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) formulering av Neulasta (pegfilgrastim). Adv. Drug Delivery Recensioner. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) förutsäger Kristallisationsbenägenheten hos Karboxylsyrabuffertar i frysta system—relevans för frystorkning. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) termofysiska egenskaper hos karboxyl-och Aminosyrabuffertar vid temperaturer under noll: Relevans för frusen Tillståndsstabilisering. J. Phys. Chem. B. 115, 7154-7164
om författaren
David Sek fick sin BS i kemi från Bates College och hans MS i Kemi och kemisk biologi från Northeastern University. Han har 10 års erfarenhet som formuleringsforskare och har tillbringat de senaste åtta åren på Pfizer och studerat stabiliteten hos nya bioterapeutika.