Legea SUA privind alimentele, medicamentele și cosmeticele din 1938 impunea producătorilor și companiilor farmaceutice să fie responsabili pentru siguranța aditivilor / excipienților de droguri din produsele lor ca răspuns la o tragedie în care 100 de copii au fost uciși din cauza prezenței dietilen glicolului într-un produs antibacterian. Pentru a ajuta la clarificarea a ceea ce este necesar pentru a stabili un nou excipient, FDA a lansat un document de orientare în 2005 intitulat ‘studii nonclinice pentru evaluarea siguranței excipienților farmaceutici’, subliniind studiile de siguranță necesare pentru a avea un excipient aprobat1,2. Articole recente au solicitat necesitatea mai multor excipienți alternativi pentru utilizarea în formulări1, 3, 4. Formulatorii preferă, în general, excipienții precedenți din cauza profilului lor de siguranță bine stabilit, precum și a riscurilor și costurilor asociate aprobării unui nou excipient3. Atunci când se califică un nou excipient, trebuie efectuate studii de siguranță și, în cazul unui eveniment advers, există îndoieli cu privire la faptul că evenimentul advers s-a datorat excipientului sau produsului. Atunci când se utilizează un excipient, în timp ce experiența anterioară cu orice cale de administrare injectabilă este valoroasă în justificarea utilizării sale, este de remarcat faptul că,în conformitate cu reglementările actuale, schimbarea căii de administrare sau creșterea concentrației peste doza cea mai mare actuală poate necesita date suplimentare de siguranță1, 2. Nevoia de noi excipienți este bine recunoscută, dar extinderea cunoștințelor noastre în utilizarea excipienților mai puțin utilizați pe scară largă este la fel de importantă, oferind în același timp o cale de reglementare mai ușoară.
determinarea pH-ului corect și a sistemului tampon este, fără îndoială, cea mai critică etapă în formularea unei proteine pentru a asigura solubilitatea și stabilitatea (chimică și fizică)3,5-7. Articolul se va concentra pe stabilizarea bioterapeuticelor. Tampoanele găsite atât în molecule mici, cât și în formulările parenterale proteice aprobate de FDA vor fi menționate ca justificare pentru explorarea efectelor stabilizatoare ale acestor tampoane asupra proteinelor. Tabelul 1 enumeră numărul de formulări unice găsite căutând etichetele produselor aprobate de FDA. Au fost excluse formulările identice rezultate din formularea de produse generice sau concentrații diferite de dozare. Ori de câte ori se face aluzie la forma de sare a tamponului, se presupune că tamponul este titrat cu hidroxid de sodiu sau acid clorhidric, deoarece acestea sunt cele mai frecvente titrante.
cele mai frecvente tampoane găsite a fi utilizate în formulările parenterale au fost citratul, fosfatul și acetatul. Unele dintre punctele forte și punctele slabe asociate cu acești excipienți vor fi evidențiate. Scopul acestei lucrări este de a atrage atenția asupra altor agenți de tamponare aprobați, dar mai puțin utilizați, care necesită o utilizare mai extinsă pentru a deveni general acceptați. În timp ce acest articol se va concentra exclusiv pe tampoane, același argument se extinde și la alte tipuri de excipienți. Pe măsură ce biotehnologia evoluează ca industrie și se dezvoltă mai multe structuri proteice unice, va deveni din ce în ce mai important să se găsească noi modalități de stabilizare a acestor proteine. Uneori, cei mai comuni excipienți nu vor fi suficienți pentru a oferi o stabilitate adecvată sau pentru a permite tehnologii de livrare a medicamentelor.
experții din industrie de la AbbVie, Vectura și Bayer discută despre cele mai bune practici și experiențele lor de transformare digitală în cea mai recentă masă rotundă
urmăriți sesiunea noastră de o oră pe tema ‘descoperiți potențialul laboratorului dvs.-Descoperiți cum transformarea digitală poate fi mult mai mult decât simple informații’, în care grupul nostru explorează modul în care transformarea digitală poate ajuta la accelerarea procesului decizional, la optimizarea proceselor și la eliminarea ineficiențelor operaționale. Veți obține o înțelegere a modului în care implementarea unei soluții de gestionare a datelor a ajutat organizațiile să implementeze noi metodologii și să transforme procesele de flux de lucru
urmăriți acum
tampoanele utilizate în mod obișnuit
fosfat de sodiu
fosfat de sodiu (pKa 2.1, 7.2 și 12.3) este cel mai frecvent utilizat tampon găsit în formulările parenterale (Tabelul 1). Cea mai notabilă limitare în utilizarea fosfatului ca tampon este efectul înghețării asupra modificărilor pH-ului. schimbarea pH-ului în timpul înghețării a fost studiată pe larg. Schimbarea pH – ului este atribuită cristalizării selective a sării dibazice. Cristalizarea poate fi afectată de viteza de înghețare, de pH-ul inițial și de prezența altor cosolute. O schimbare a pH-ului de aproximativ două unități este destul de tipică în timpul înghețării, dar au fost raportate schimbări ale pH-ului până la 3,6 unități8-10. Mediul în schimbare al pH – ului are potențialul de a destabiliza proteinele în timpul procesării substanței medicamentoase în vrac sau a liofilizării soluțiilor de produse medicamentoase11-17. Acest lucru este cel mai îngrijorător în condițiile în care se utilizează concentrații mari de fosfat sau sunt prezenți alți excipienți de cristalizare, deoarece aceste condiții ajută la inducerea cristalizării fosfatului. Soluțiile care conțin concentrații mari de proteine sau substanțe dizolvate necristalizabile (de exemplu zaharoză) vor inhiba cristalizarea fosfatului și vor reduce la minimum schimbările de pH.
acid Citric
acidul Citric este unul dintre tampoanele cele mai frecvent utilizate (Tabelul 1). Este un tampon trivalent care conține trei acizi carboxilici cu pKa de 3,1, 4,8 și 6,4 (Tabelul 2) oferind o gamă largă de tamponare5. Conform bazei de date a ingredientelor Inactive ale FDA, citratul se găsește în peste 100 de produse injectabile aprobate, oferindu-i un istoric mare de utilizare și dovedind siguranța acestuia.
cu toate acestea, studiile care au comparat injecțiile subcutanate de formulări tamponate cu citrat cu formulări com parabolice tamponate cu fosfat sau histidină au stabilit că soluțiile cu citrat au indus mai multă durere la injectarea subcutanată18-20. Deși această durere a avut o durată relativ scurtă (mai puțin de două minute), aceasta ridică îngrijorări cu privire la respectarea de către pacient a injecțiilor care conțin citrat18. La formularea cu acid citric, trebuie notat profilul țintă al produsului și calea de administrare preconizată. Atunci când se intenționează injecții subcutanate frecvente, un alt agent de tamponare poate fi mai adecvat.
acid Acetic
acidul Acetic are un pKa de aproximativ 4,8, oferind un interval de tamponare de 3,7-5,6 (Tabelul 2). Utilizarea acidului acetic este ideală pentru formularea proteinelor stabile în stare lichidă în condiții acide. Liofilizarea soluțiilor de acid acetic este însoțită de o creștere a pH-ului datorită sublimării formei acide volatile a tamponului, lăsând în urmă sarea bazică. Acest lucru poate destabiliza proteina și îngreunează controlul pH-ului în produsele medicamentoase liofilizate.
tampoane suplimentare aprobate
trometamina
trometamina (Tris) (pKa 8.1) are proprietăți similare cu fosfatul (pKa 7.2) și ar putea fi folosit ca înlocuitor în apropierea condițiilor de pH neutru. Ambele tampoane prezintă o modificare a pH-ului în timpul înghețării. În condiții identice, schimbarea pH-ului pentru trometamină (+2.1) a fost aproximativ egală cu cea a fosfatului ( 1.8), dar în direcția opusă (Tabelul 2)8.
alegerea unui tampon față de altul ar depinde probabil de sensibilitatea proteinei individuale la direcția schimbării pH-ului și de orice interacțiune specifică proteină-tampon. Trometamina și histidina s-au dovedit a fi stabilizatori mai buni decât fosfatul atunci când eritropoietina a fost supusă unui stres la temperaturi ridicate, prevenind agregarea ajutând la reversibilitatea desfășurării21. Ure2p s-a dovedit a fi mai stabil împotriva formării fibrilelor atunci când este formulat în trometamină versus fosfat22.
histidina
histidina, un aminoacid esențial, devine din ce în ce mai frecventă în formulările terapiei proteice. Având un pKa de 6,1, este ideal pentru formulările proteice în apropierea condițiilor neutre (Tabelul 2).
s-a demonstrat că histidina protejează un anticorp monoclonal atât în stare lichidă, cât și liofilizată împotriva stresului termic23-25. Studiile care au examinat stabilitatea interferonului-tau au arătat că formulările care conțin histidină (urmate de Tris apoi fosfat) au fost cele mai stabile împotriva agregării induse de căldură. Această stabilizare a fost atribuită legării directe a histidinei de proteină26. În timpul liofilizării, s-a demonstrat că histidina și acidul aspartic protejează anticorpii acționând ca un donator de legături de hidrogen pentru a conserva foile intramoleculare de celule x24-25. În plus,s-a constatat că histidina are proprietățile unui antioxidant datorită capacității sale de a lega ionii de fier și oxigenul singlet24, 27. Dezavantajul utilizării histidinei este că s-a observat că soluțiile de histidină își schimbă culoarea la temperaturi accelerate și pH acid, precum și extrag fierul din oțel inoxidabil24.
acid Gluconic, lactic și tartric
acidul gluconic, lactic și acidul tartric sunt excipienți care au fost utilizați aproape exclusiv în formulări cu molecule mici. Gluconatul de calciu a fost autorizat pentru tratamentul arsurilor cu fluorură de hidrogen printr-o aplicație topică. În cazuri mai severe, o perfuzie cu o soluție de gluconat de calciu de patru procente în soluție salină a fost utilizată pentru prevenirea leziunilor tisulare28. Din cele 23 de formulări injectabile disponibile în comerț care conțin acid lactic găsite în baza de date a ingredientelor inactive FDA, patru formulări sunt utilizate pentru produse biologice – două peptide și două proteine. Dintre cele 12 formulări care conțin acid tartric, doar una a fost utilizată în formularea unei proteine. Aceste tampoane pot fi înlocuitori adecvați pentru acetat și citrat.
acidul Gluconic este un compus format în mod natural din oxidarea glucozei. Este un compus interesant, deoarece are potențialul de a acționa ca un tampon, stabilizator și agent chelator datorită faptului că are o structură care conține acizi carboxilici și grupări hidroxil.
s-a demonstrat că Tartaratul îmbunătățește retenția monomerului față de citrat într-o formulă de anticorpi la pH 4,0-4,5 atunci când este păstrat sub formă de lichid la 25 C29. S-a emis ipoteza că grupările hidroxil din tartarat, citrat, malat și prin extensie lactat și gluconat ar putea furniza legături Stabilizatoare de hidrogen în faza amorfă a unui tort liofilizat 30-31.
acid Aspartic și glutamic
atât acidul aspartic, cât și acidul glutamic se găsesc în perfuzii administrate sugarilor și copiilor cu concentrații plasmatice insuficiente de aminoacizi. În TrophAmine inkst, aspartatul și glutamatul sunt perfuzate la concentrații de 22 mm și respectiv 34 mm32. Aceste concentrații sunt suficient de mari pentru a asigura tamponarea adecvată a formulelor proteice.
acidul Glutamic,atunci când este formulat cu cantități egale de arginină,s-a dovedit că îmbunătățește stabilitatea și solubilitatea proteinelor intra-celulare23, 33, precum și previne agregarea în timpul reconstituirii23, 34-35. Studiile privind insulina și albumina serică umană indică faptul că adăugarea de glutamat și aspartat au putut inhiba formarea agregatelor36-38. Studiile cu pegfilgrastim au indicat că stabilitatea pegfilgrastimului formulat în glutamat sau formiat a fost comparabilă cu cea a acetatului39.
intermediarii ciclului acidului Citric
citratul, fumaratul, cetoglutaratul, malatul și succinatul sunt toți intermediari în ciclul acidului citric care s-au dovedit a fi siguri și eficienți ca tampoane sau contra ioni în formulările injectabile. Într-un număr limitat de produse s-au utilizat fumaratul, cetoglutaratul, malatul și succinatul (tabelul 1). Este evident că ceilalți intermediari ai ciclului Krebs pot fi, de asemenea, adecvați pentru utilizare parenterală. Acești compuși includ aconitat, izocitrat și oxaloacetat. Fiind acizi carboxilici bivalenți și trivalenți, aceștia au pKa-uri cuprinse între 2,0 și 6,4, făcând acești compuși adecvați pentru o gamă largă de formulări (Tabelul 2).
datorită utilizării limitate a acestor compuși ca tampoane, nu este clar dacă aceeași durere la injectare asociată cu injecțiile subcutanate de citrat ar fi asociată cu acești compuși. Cu toate acestea, există și alte avantaje asociate cu utilizarea lor. S-a demonstrat că citratul induce gelificarea soluțiilor de anticorpi atunci când concentrația proteică a fost mai mare de 100 mg/mL. Acest lucru a fost atribuit naturii trivalente a tamponului. Succinatul, având doar doi acizi carboxilici, nu a fost găsit să aibă același efect la același pH40.
concluzie
determinarea pH-ului corect și a sistemului tampon este esențială pentru aducerea bioterapeuticelor în clinică și pe piață. Nevoia de noi excipienți, precum și o mai bună înțelegere a excipienților existenți este foarte de dorit. Histidina, trometamina și o serie de alte tampoane alternative oferă avantaje față de excipienții utilizați în mod convențional. Utilizarea acestor tampoane alternative nu poate face altceva decât să ajute la mărirea instrumentelor pe care le au formulatorii și poate permite dezvoltarea unui tratament terapeutic care altfel ar fi eșuat. Pentru a stabiliza numărul mare de terapii proteice în curs de dezvoltare, toate abordările ar trebui să fie deschise pentru examinare.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011) tendințe în evaluarea siguranței excipienților. Int. J. Toxicologie. 30, 600-610
2. FDA (2005) Ghid pentru industrie: studii non-clinice pentru evaluarea siguranței excipienților farmaceutici
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) tampoane: principii și practică. Metode în enzimologie. 182, 24-38
6. Trevino, Sr, Scholtz, JM, Pace, CN (2008) măsurarea și creșterea solubilității proteinelor. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010) agregarea proteinelor-căi și factori de influență. Int. J. Farmaceutice. 390, 89–99
8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) minimizarea agregării soluțiilor neutre de insulină. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) formularea Neulasta (pegfilgrastim). ADV. Recenzii De Livrare De Droguri. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) prezicând tendința de cristalizare a tampoanelor de acid carboxilic în sistemele congelate—relevanță pentru liofilizare. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) proprietăți termofizice ale tampoanelor carboxilice și de aminoacizi la temperaturi sub zero: Relevanță pentru stabilizarea stării înghețate. J. Phys. Chem. B. 115, 7154-7164
despre autor
David SEK și-a câștigat BS în chimie de la Colegiul Bates și MS în chimie și biologie chimică de la Universitatea Northeastern. Are 10 ani de experiență ca om de știință în domeniul formulării și și-a petrecut ultimii opt ani lucrând la Pfizer studiind stabilitatea noilor bioterapeutice.