Sabes que se sobrepõem, mas podes prová-lo?

Microscopia por padrão é uma técnica que nos permite observar, ao invés de medir, eventos biológicos e fazer conclusões com base no que vemos, ao invés de baseado em alguns cálculos. O tema deste artigo pode, portanto, parecer um pouco surpreendente, uma vez que trata das medidas de colocalização. Embora existam situações em que você pode determinar a co-comercialização de proteínas visualmente, uma confirmação mais precisa de uma distribuição mútua de duas sondas muitas vezes será necessária.Por que uma determinação Visual da colocalização é insuficiente?

somente se você tiver coletado imagens seguindo um protocolo controlado para análise de colocalização (sinal suficiente em cada canal, sem auto-fluorescência ou sangramento de sinal) é seguro dizer que as duas sondas se focalizam apenas com base na observação. Neste caso, se o sinal verde colocaliza com o sinal vermelho e a imagem é principalmente amarela, nenhuma medição estatística é necessária. Mas se você não vê uma sobreposição, isso não significa que não está lá! Pode acontecer que as intensidades dos dois canais não sejam as mesmas. Ou seja, a cor intermediária que vemos só pode aparecer se ambas as sondas forem da mesma intensidade. Por conseguinte, as conclusões baseadas na determinação visual podem conduzir frequentemente a resultados falsos negativos.

quais os métodos de medição sobreposta existem?Apesar de não haver uma abordagem padrão nesta matéria, existem dois métodos que são amplamente utilizados e geralmente aceites. Estes envolvem o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) ou o coeficiente de colocalização de Mander (MCC).

estes dois métodos referem – se a dois aspectos diferentes da colocalização-correlação e co-ocorrência. O coeficiente de Pearson está relacionado com a correlação das intensidades de pixels nos dois canais. Mede a relação entre Sinais-se os valores de sinal em um canal sobem simultaneamente com o outro, ou um sinal cai quando o outro sobe. A correlação é distinta da co-ocorrência, que é expressa matematicamente através do coeficiente de Mander. Isto representa a cobertura de um sinal sobre o outro, o que revela a extensão em que duas sondas ocupam o mesmo lugar. Vamos explorar isto um pouco mais.

coeficiente de correlação de Pearson (PCC)

definição: PCC reflete a relação linear entre as intensidades do sinal. Os valores podem variar entre 1 (correlação positiva perfeita) e -1 (correlação negativa perfeita), enquanto 0 significa que não há correlação. É possível explorar o PCC visualmente através de um scattergram onde as coordenadas no gráfico representam valores de pixels (sinal) em ambos os canais. Os pontos mais que se aglomeram em torno de uma linha reta, o melhor a correlação entre os dois sinais

Requisitos: O PCC deve ser medido na região de interesse (ROI) para evitar falsos positivos ou negativos. Se a medição do PCC em toda a imagem, os pixels do fundo se correlacionarão perfeitamente e inflarão o PCC. Em contrapartida, se a medição for realizada numa região sem interesse em que exista uma distribuição heterogénea de ambos os canais, o PCC será reduzido.

você pode selecionar ROI à mão ou debulhando para excluir o fundo. Seja como for, Tem cuidado, especialmente quando debulhares. A selecção do ROI deve incluir todas as regiões relevantes da(s) célula (s), ou seja, todos os locais onde se pode esperar que uma sonda se distribua. Se você está usando um método baseado em intensidade para selecionar ROI (thresholding), você pode inadvertidamente excluir resultados relevantes. Como é que isto pode acontecer? Você pode ter uma região de exclusão mútua, onde nenhum rótulo aparece, e este pode ser um resultado biologicamente relevante (ambas as moléculas não são expressas nesse lugar na célula). No entanto, a thresholoding não irá incluir esta região no ROI, colocando-o em risco de perder resultados relevantes.Recomenda-se a utilização de PCC nas imagens caso exista uma relação linear entre as intensidades. Se os dados se ajustarem a um modelo mais complexo, o PCC não funcionará bem. Deve também ser escolhido um método diferente se houver uma sobreposição desigual, em que as sondas Co-distribuem, mas em proporções diferentes. Isto pode ocorrer quando GFP é usado como uma sonda. Seu nível de expressão pode diferir entre as células, e potencialmente causar depressão de PCC devido à alta variabilidade intercelular.

os coeficientes de colocalização de Mander

definição: MCC é uma métrica que descreve a co-ocorrência – a fração de uma proteína que colocaliza com a outra. A MCC lhe dará uma boa medida de colonização quando você rotular uma proteína em uma vesícula e quiser ver como ela colocaliza com uma determinada estrutura em uma célula, digamos um microtúbulo. Se assumirmos que todas as vesículas se colocalizam com microtúbulos, mas apenas uma proporção de microtúbulos se colocaliza com a vesícula, podemos calcular MCC para cada canal e obter uma métrica que descreve quantitativamente esta sobreposição fraccional.

Requisitos: a captura com MCC é que requer a eliminação do fundo. A parte mais complicada aqui é definir um ponto de corte para a intensidade que irá permitir a subtração de fundo. A MCC mede a fluorescência completa de uma sonda em cada pixel acima de zero. No entanto, acima de zero pixels são extremamente raros, devido a fatores como: auto-fluorescência, fuga de luz, rotulagem não específica, ou fluorescência de planícies de foco. A medição da MCC requer, portanto, uma seleção cuidadosa do limiar (limite).

a primeira maneira de fazer isso é a thresholding global, onde você subtrai um valor limiar de cada pixel, de modo que cada nível abaixo do recorte selecionado será o fundo e cada pixel acima cairá em uma região de interesse. Embora isso seja muito intuitivo, o thresholding global é bastante bruto e pode levar a situações indesejadas, como a exclusão dos pixels de baixo valor que estão perto do fundo, mas são de fato positivos.

uma opção mais automática e menos subjetiva é o método Costes, onde o limiar é estimado calculando PCC múltiplas vezes. Isto serve para definir a gama de valores de pixels que são positivos e, portanto, não devem ser excluídos. O PCC é calculado para diferentes grupos de pixels, e os valores de pixels para os quais o PCC é igual ou próximo de zero são considerados como valores-limite. No entanto, ele também deve ser verificado visualmente, uma vez que em imagens com menor relação sinal-ruído ele pode identificar um nível de limiar muito baixo para que ele não distingue estruturas rotuladas do fundo.

recomendado para: quando a questão biológica da sua experiência diz respeito à medida em que as proteínas/estruturas se sobrepõem, a MCC deve ser a medida de escolha. Estes coeficientes são interpretados mais intuitivamente do que PCC, e são independentes da proporcionalidade do sinal (as diferenças no número de estruturas rotuladas por cada sonda).Antes de iniciar a sua análise, seja qual for a escolha para medir a colocalização que escolher, é muito importante que a colecção de imagens seja realizada de forma correcta. Tente controlar o máximo de fatores que puder, e prepare um conjunto de amostras de controle que lhe permitam monitorar o maior número possível de variáveis.

tenha em mente que o visual colocalization determinação é influenciada por muitos fatores, incluindo a subjetividade do observador, o fato de que cada indivíduo cérebros podem ver as cores de maneira diferente, de uma possível cegueira da cor do observador, e a resolução espacial que determina o tamanho do pixel, entre outros. Certifique-se de processar as imagens que você está prestes a analisar de uma forma uniforme, e tenha em mente que qualquer manipulação descontrolada pode fazer com que você perca informações relevantes.Estes cálculos são implementados na maioria dos pacotes de software de análise de imagens, por exemplo, ImageJ e Volocity. Mas, dado que a colocalização de medição ainda é um campo um pouco confuso, melhorias são necessárias, então mantenha o controle das novas versões e pacotes para o software.Como mede a colocalização? Deixe-nos saber escrevendo na seção de comentários!

literatura:

Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-c742

Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Colocalization Analysis in Fluorescence Microscopy. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, pp. 97-109

Mcdonald JH, Dunn KW. Testes estatísticos para medidas de colocalização em microscopia biológica. Diário de microscopia. 2013; 252(3): 295-302