1.4.1 meio de homogeneização
ruptura celular é geralmente realizada em um meio hipossmótico ou iso-osmótico para preservar a integridade morfológica. A sacarose é comumente utilizada como um osmótico para prevenir organelas ou vesículas subcelulares de inchaço ou encolhimento adversos. Também foram utilizados manitol e sorbitol quando se verificou que a sacarose interfere com a análise bioquímica do componente subcelular. A sacarose é preferida às soluções salinas porque estas tendem a agregar organelas subcelulares. Os meios hipossmóticos são frequentemente utilizados no isolamento de fracções de membrana plasmática porque, nestas condições, as células perturbadas produzem membranas de plasma sob a forma de grandes fantasmas ou folhas. Isso reduz significativamente o alto grau de variação no tamanho destes fragmentos antes da centrifugação. Embora o meio de homogeneização seja geralmente de natureza aquosa, meios não aquosos como éter/clorofórmio têm sido usados para isolar organelas subcelulares. No entanto, os meios não aquosos podem inactivar algumas enzimas e reduzir a integridade morfológica de alguns tecidos.
agentes Quelatantes (EDTA ou EGTA) podem ser adicionados ao meio de homogeneização para remover catiões divalentes, tais como Mg2+ ou Ca2+ que são exigidos pelas proteases de membrana. É importante notar que os inibidores da protease ainda devem ser incluídos no meio porque os reagentes EDTA e tiol podem activar algumas enzimas proteolíticas. No entanto, muitas enzimas marcadores de membrana requerem estas catiões para a actividade e podem ser inibidas após as catiões terem sido removidas do extracto. A adição de Mg2+ ou Ca2+ ao meio de homogeneização mantém a integridade nuclear. No entanto, estes íons podem causar agregação de membrana e diminuir o controlo respiratório nas mitocôndrias.
ruptura celular do tecido vegetal muitas vezes liberta fenóis que podem ter vários efeitos deletérios nas enzimas vegetais. Os compostos fenólicos vegetais compreendem essencialmente dois grupos: os compostos fenilpropanóides (por exemplo, taninos hidrolisáveis) e os flavonóides (por exemplo, taninos condensados). Os fenólicos podem ligar-se a hidrogénio com ligações peptídicas de proteínas, ou sofrer oxidação por fenol oxidase a quinonas. Quinonas são poderosos agentes oxidantes que também tendem a polimerizar e condensar com grupos reativos de proteínas para formar um pigmento escuro chamado melanina que forma a base da browning do tecido vegetal. A ligação da melanina às proteínas pode inactivar muitas enzimas. Grupos fenólicos hidroxila podem formar interações iônicas com aminoácidos básicos de proteínas ou interagir hidrofóbica com regiões hidrofóbicas de proteínas. Portanto, é importante para remover os compostos fenólicos, como o mais rapidamente possível e isto é melhor conseguido utilizando adsorventes que se ligam aos fenóis ou quinones ou usando agentes de proteção, tais como borato, germanate, sulfitos e mercaptobenzothiazole que inibem o fenol oxidase atividade. O adsorvente fenol, a polivinilpirrolidona, sob uma forma solúvel em água ou como produto insolúvel altamente reticulado, “Policlar”, pode ser adicionado ao meio de isolamento. A polivinilpirrolidona liga-se aos compostos fenólicos que formam fortes ligações de hidrogénio com proteínas. A albumina sérica bovina também tem sido relatada para reagir com fenóis vegetais e é também um necrófago de quinona eficaz.O fraccionamento celular ou tecidular é invariavelmente realizado a +4°C para reduzir a actividade das proteases de membrana. As Proteases podem ser subdivididas em endopeptidases e exopeptidases. Endopeptidases, que são enzimas que clivam ligações peptídicas internas, incluem: proteases ácidas que têm um pH óptimo de pH 2, 5-3, 8 e podem ser inibidas pelo inibidor do Estado de transição da pepstatina.; proteases de serina que podem ser inibidas pelo diisopropilfluorofosfato e pelo fenilmetilsulfonilfluoreto; e proteases de sulfidril que são inibidas pelo N-etilmaleimida ou pelo e-64 (l-trans-epoxisuccinil-leucilamida–butano). Exemplos de exopeptidases incluem carboxipeptidases que estão presentes na maioria dos tecidos vegetais e facilmente hidrolisam a maioria dos aminoácidos C-terminal. Todas as carboxipeptidases vegetais estudadas até à data são inibidas pelo difluorofosfato de diisopropilo. As Aminopeptidases, as dipeptidases e as tripeptidases também foram identificadas em plantas. Outros compostos utilizados em meios de homogeneização incluem agentes redutores de dissulfeto, tais como 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, glutationa reduzida ou cisteína. Isto porque muitas enzimas contêm um grupo sulfidrilo local activo essencial que deve permanecer reduzido a fim de manter a actividade enzimática. Muitos dos problemas de isolamento organela estão associados à ruptura das membranas frágeis, por exemplo o tonoplasto em torno do vacúolo. Para além da destruição física destas membranas, os tecidos vegetais contêm enzimas lipolíticas activas que podem atacar os componentes lipídicos das membranas directamente e perturbar as organelas. Os ácidos gordos livres libertados pela acção hidrolítica das acil hidrolases podem inibir as actividades da ATPase das mitocôndrias, cloroplastos e membranas plasmáticas. Outros efeitos deletérios dos ácidos gordos também estão bem estabelecidos. Existem determinadas condições que podem reduzir a degradação lipídica por lipases e acil-hidrolases lipolíticas nas plantas. Estes incluem a utilização de (1) um meio de isolamento com um pH de 7.5-8 em que a maioria das enzimas lipolíticas e lipooxygenases apresentam pouca atividade, (2) agentes quelantes como o EDTA, porque muitos phospholipases são de Ca2+ dependentes; muitas enzimas lipolíticas, no entanto, não são afetados por agentes quelantes e (3) outros aditivos como anti-oxidantes para evitar oxidativo desagregação de ácidos graxos hydroperoxides, bissulfeto de agentes redutores, inibidores de enzimas específicas e o uso de ácido graxo livre de albumina de soro bovino que liga a ácidos graxos livres. Cada meio de homogeneização individual é diferente e pode conter inibidores específicos para enzimas tais como fosfolipases ou phos-phatases. O glicerol, por exemplo, é frequentemente adicionado ao meio de isolamento para inibir a fosfatase do ácido fosfatídico. A etanolamina e o cloreto de colina são comumente utilizados para inibir a fosfolipase D.
a capacidade tampão do meio de homogeneização para fraccionamento de células vegetais deve ser elevada, a fim de compensar a libertação de ácidos orgânicos pelo vacúolo interrompido, que constitui um volume substancial da célula. O meio de homogeneização pode ser formulado por avaliação empírica ou por análise racional. Por exemplo, para garantir que a proteína purificada relevante permanece intacta, todos os principais inibidores das proteases podem ser adicionados ao meio de homogeneização ou, alternativamente, podem ser copiadas soluções fisiológicas. Desde o pH citoplasmático da célula da planta é de cerca de 7.5–8.0, a homogeneização médio deve refletir o estado fisiológico da célula e, portanto, é fracamente tamponada a pH citoplasmático.