Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é um método importante para a monitorização da regulação transcriptional com conhecimento não descoberto das interações entre proteínas específicas e uma região genômica do DNA. Dado que as proteínas de ligação ao ADN (incluindo os factores de transcrição e as histonas) nas células vivas podem ser cruzadas com o ADN que se liga, o ChIP é utilizado para imunoprecipitar o complexo proteína-ADN a partir de lisatos celulares por um anticorpo apropriado. Os complexos imunoprecipitados são coletados por centrifugação, e as proteínas são eludidas para análise posterior, como western blot e LC/em Análise de ácido nucleico é alcançado através de PCR, RT-PCR, sequenciação de cDNA e microarray. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para alcançar o teste de ChIP bem sucedido de uma maneira rápida e eficiente.
Reagentes:
- 37% formaldeído
- 1 M glicina
- tampão de lise Celular: 150 mM NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0,5% DO NP-40, 1% Triton X-100, com 1× inibidor da protease do cocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Adicionar 27 µL a 37% de formaldeído por 1 mL de meio de cultura para obter uma concentração final a 1%, incubar as células durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto agita lentamente um dispositivo de balanço ou agitação.
2. Eliminar a ligação cruzada adicionando 141 µL de glicina por 1 mL de meio de cultura para obter uma concentração final a 125 mM, incubar as células durante 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Para as células flutuantes: células coletadas num tubo cónico de 15 mL, centrifugar a 2000 × g a 4 ° C durante 5 minutos. Eliminar o sobrenadante e lavar duas vezes as células com borracha termoplástica de estireno-butadieno-estireno a frio.
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4. No caso das células adesivas: remover o meio, lavar duas vezes as células com borracha termoplástica de estireno-butadieno-estireno a frio. Raspar as células em PBS num tubo cónico de 15 mL, centrifugar a 2000 × g a 4 ° C durante 5 minutos.
lise e sonicação
5. Eliminar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão de lise de células Frias por 1 × 107 células. Ressuspender o sedimento pipetando para cima e para baixo várias vezes, e incubar no gelo durante 10 minutos.
6. Sonicate to shear the chromatin into 0,5 ~ 1 kb fragment. Evitar espuma e manter a amostra em gelo.
notas:As condições de sonicação devem ser optimizadas dependendo da amostra e do modelo de sonicador. Tipicamente, seis pulsos de 15 segundos seguidos por períodos de repouso de 45 segundos na saída 6.0 foram encontrados para trabalhar. Para análise do tamanho do fragmento, extrair um pequeno volume de DNA total de uma alíquota de cromatina queimada, e então analisar em um gel de agarose (1~2%).
7. Centrifugar a 12 000 × g a 4°C durante 10 minutos e reter o sobrenadante.
8. Transferir 0,5 mL de sobrenadante para um 1 fresco.Tubo de 5 mL para análise de fragmentos de ADN.
Imunoprecipitação
9. Adicionar anticorpos relevantes ou IgG normais à amostra e incubar durante 15 minutos num banho de água ultrassónico à temperatura ambiente.
notas:
- escolha IgG da mesma espécie onde os anticorpos foram produzidos.
- o tempo de incubação deve ser optimizado dependendo do anticorpo e do antigénio. Para antigénios com um baixo nível de expressão, a incubação pode ser efectuada a 4°C durante a noite numa plataforma rotativa .
10. Preparar contas de proteína a-agarose: lavar as contas três vezes com 1 mL de tampão de lise (sem inibidor da protease), centrifugar a 2000 × g durante alguns segundos a 4°C e depois eliminar o sobrenadante.
11. Contas diluídas 1: 1 com tampão de lise e adicionar 50 µL à amostra.
12. Incubar a 4 ° C durante 30~45 minutos numa plataforma rotativa.
13. Centrifugar a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C e depois eliminar o sobrenadante.
14. Lavar quatro vezes as contas com 1 mL de tampão de lise (sem inibidor da protease) e eliminar o sobrenadante.Depuração e análise do ADN
15. Ressuspender as esferas lavadas com 100 µL de 10% de Quelex 100.
16. Pipetar para cima e para baixo durante vários segundos e, em seguida, ferver a amostra durante 10 minutos.
17. Centrifugar a 12 000 × g durante 1 minuto à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL fresco.
18. Purificar o ADN utilizando um kit de purificação de ADN ou por um protocolo padrão de extracção de clorofórmio.
19. Dissolver o DNA com 50 µL de ddH2O, e usar 2~10 µL da amostra de DNA (25% do volume de reação) em reacções PCR
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