Quimeras

o que você irá fornecer Parte I

• um número de conta.
• uma linha celular sem micoplasma com 40 cromossomas.

o que vamos fazer

• vamos injectar aproximadamente 50 blastocistos por linha celular de ES. Isto deve resultar no nascimento de 10 ratos. Espera-se que três dos ratos sejam Quimeras masculinas fortes. Temos um histórico de sucesso comprovado.
• alojaremos os ratos até ao desmame (três semanas após o nascimento).

o que irá fornecer Parte II

• irá alojar os ratos desmamados.

custo

• $ 3,300 por 129 Linha celular e o custo das fêmeas dadoras; $ 4,950 por linha celular e o custo das fêmeas dadoras por outros antecedentes genéticos.
• as encomendas locais, não-cadru serão cobradas um adicional de $200 por embalagem e transporte de ratos. As encomendas não-locais serão cobradas $ 200 e os custos de transporte.

Conformidade Regulamentar

• os investigadores necessitam de um protocolo IACUC da sua instituição para receber ratos do núcleo. Os protocolos cadru IACUC precisam especificar a utilização do núcleo transgênico caso. Os investigadores não necessitam de um protocolo IBC próprio, normalmente: a análise do ADN recombinante em animais será efectuada com base nas informações apresentadas através de pedidos em linha para o núcleo transgénico e será adicionada ao protocolo IBC do núcleo, como alteração, se aprovado. Pode ser contactado pelo IBC para obter informações adicionais no âmbito da revisão do rDNA após a apresentação do pedido. É necessária a aprovação da IBC antes do início das injecções.Pedimos-lhe que reconheça o caso transgénico e o serviço de orientação em seminários e publicações.

Cronograma

• De injeção data de células, será, no mínimo, 6 semanas antes de nós será capaz de entregar ratos para você (quase 3 semanas de gestação, e pelo menos 3 semanas de crescimento pós-natal antes do desmame). Serão mais 6 semanas antes que as quimeras masculinas tenham idade suficiente para procriar, e um mínimo de 6 semanas antes que você tenha desmamado a descendência até o genótipo para testar a transmissão de linha germinal–um total de 4.5 meses desde a injecção até à análise da transmissão da linha germinal.
• o tempo actual (3/25/21) esperado entre a colocação da encomenda e a injecção de células e é de 8 semanas. Durante as 8 semanas anteriores à injecção, o pedido de quimera é revisto pelo Comité ADNR do IBC, as células ES são descongeladas e cultivadas, e os ratos são encomendados e recebidos.

Taxa de Sucesso na Geração de Quiméricas Ratos

O núcleo gera uma média de cerca de 5 quimeras por célula da linha.

começar
a probabilidade de transmissão de uma mutação orientada por germinas é aumentada com o número de linhas de células ES independentes disponíveis. Em média, cerca de dois terços a três quartos das linhagens de células ES no fundo genético de 129 irão para a linha germinal. Para as linhas de células ES sobre o fundo C57, uma média de apenas metade a dois terços das linhas irá germline. Portanto, se você está comprando linhas celulares es direcionadas a partir de um repositório público, recomendamos que você compre 3 ou mais corretamente linhas direcionadas sobre o fundo 129, e 4 ou mais linhas sobre o fundo C57. Do mesmo modo, encomenda 2 ou mais injecções para 129 linhas, e 3 ou mais para linhas C57. Para a geração de knockouts específicos aos tecidos com alelos condicionais em células ES DE EUCOMM, veja o nosso primer.O que são Quimeras?
tipicamente, Quimeras são construídas para gerar ratos a partir de linhas de células ES presas em genes. As células ES injectadas em embriões hospedeiros dão origem a ratos mosaicos conhecidos como Quimeras.As células do sexo masculino são injectadas em blastocistos não amaldiçoados. Se o embrião hospedeiro é feminino e as células ES masculinas fazem células germinativas, a quimera muitas vezes será um macho fértil. Embriões hospedeiros de uma estirpe que não vai competir muito fortemente com as células ES são usados, e os dois componentes (es e embrião hospedeiro) são geneticamente marcados com genes de cor do revestimento de modo que a contribuição das células ES para o animal pode ser facilmente determinada. Se a proporção de descendentes de células ES no revestimento do animal é alta, a probabilidade de que as células ES são representadas em gâmetas também é alta, uma vez que as células ES se misturam completamente com as células hospedeiras no início da embriogénese. O sistema de marcação da cor do revestimento também permite determinar, com cruzamentos apropriados, se a descendência das quimeras são do componente celular ES ou componente embrionário hospedeiro.As células do C57BL/6J hospedeiro dão origem à cor do casaco preto porque são a/A (nonagouti recessivo). As células ES são da estirpe 129 de ratinhos; os embriões hospedeiros são da estirpe C57BL / 6J de ratinhos. Se estas Quimeras são criadas para ratos não agouti (por exemplo, C57BL/6J, então qualquer descendência castanha (a/a) deve ter surgido de gâmetas derivados de células ES, e 50% da descendência castanha deve ter o alelo knockout. Em alternativa, a transmissão da mutação pode ser efectuada directamente por testes PCR ou Southern blot de tecidos da descendência.Se as células ES forem da estirpe C57BL/6J (A/A, Tyr/Tyr e black), o embrião hospedeiro será albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2J/Tyrc2-J e branco). A reprodução destas quimeras para albino C57BL / 6J pode gerar descendência negra (A/a, Tyr/Tyrc-2J) a partir do componente de células ES, 50% dos quais devem transportar a mutação, e descendência branca (A/a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) a partir do componente embrionário hospedeiro.As quimeras masculinas susceptíveis de transmitir a mutação alvo podem ser identificadas por genotipagem de plug copulatório.Também fazemos quimeras de agregação e quimeras diploidtetraploides. Dois embriões pré-implantação de duas estirpes diferentes de ratinhos são combinados para formar uma quimera de agregação. Esta tecnologia pode ser usada para gerar embriões de mosaico genético para análise da autonomia e não-autonomia da ação genética e outros objetivos experimentais. Nas Quimeras diploidtetraplóides, o componente tetraplóide dá origem, em grande parte, à placenta derivada do embrião e ao componente diplóide do embrião. Este tipo de quimera pode ser usado para determinar se um gene é necessário na placenta ou embrião.Porque é que os meus ratos têm cores engraçadas? Algumas linhas de células ES são heterozigóticas para alelos de cor de casaco que só se revelam em gerações subsequentes. As células R1 129 ES que usamos são heterozigóticas em albino locus, carregando uma cópia do alelo chinchilla de albino (cch, também designado Tyrc-ch) e são heterozigóticas na diluição pink-eyed locus (p). Descendentes descendentes descendentes descendentes de células R1 ES um para o outro pode dar origem a ratos que são negros, diferentes tons de cinza, diferentes tons de marrom, ou amarelo, dependendo da variedade de alelos de cor do casaco.

o que pode ser feito para garantir a transmissão da linha germinal?A transmissão por linha germinal é maximizada com células ES que passaram um mínimo de tempo na cultura, que têm um complemento normal de cromossomas, e que estão livres de leveduras, bactérias e micoplasma. Vise uma linha celular que você sabe que é transmitida sob suas condições em sua instituição. Utilizar uma linha de células parentais com o menor número de passagem disponível (de preferência inferior ao número de passagem 16). Minimizar o tempo em que a linha alvo é cultivada. Verifique se as linhas celulares alvo têm o número normal de cromossomas. Testem a linha celular para o mycoplasma. Algumas linhas celulares não transmitirão mesmo quando todos estes parâmetros estão a seu favor. Mesmo em condições óptimas, apenas dois terços das linhas de células ES específicas serão transmitidas através da linha germinal. Portanto, comece com pelo menos três linhas celulares específicas independentes para garantir a transmissão. Tenho Quimeras fracas / Quimeras femininas. Vão transmitir o nocaute? Tanto Quimeras fracas como Quimeras femininas podem transmitir alelos mutantes, embora raramente. Quimeras masculinas que são susceptíveis de transmitir a mutação alvo podem ser identificadas por genotipagem de plug copulatório. Apenas cerca de 10% das quimeras femininas transmitem o genoma da célula ES, Quando o fazem apenas nas primeiras ninhadas, e muitos dos seus descendentes masculinos têm aneuploidias cromossómicas sexuais que os tornam inférteis (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).Porque é que as minhas Quimeras mais fortes morreram?
a mortalidade pode aumentar com a proporção do animal que vem das células ES, mesmo para as melhores linhas celulares. Esta mortalidade é devida em grande parte a aberrações epigenéticas que surgiram na cultura. Acredita-se que as aberrações epigenéticas sejam corrigidas pela subsequente criação de ratos sobreviventes, e se separariam aleatoriamente do locus-alvo, mesmo que não fossem.

a que estirpe de ratos procrio os meus mutantes?
para minimizar a variabilidade genética o mais rapidamente possível procriar as quimeras para o mesmo fundo que as células ES. Se as células ES foram 129, procriar as quimeras a 129 ratos e sua mutação será completamente sobre o 129 fundo inbred em um passo. A estirpe C57BL/6 é o pano de fundo inbred mais comum para os estudos genéticos. Se as suas células ES forem C57BL/6, atravesse as suas Quimeras até aos ratos C57BL/6J. Se você deseja mudar o fundo, o padrão é fazer 9 Cruzes seriais para a estirpe inbred da escolha (cerca de 2,5 anos). A razão para as 9 gerações é aqui explicada por Lee Silver. Alternativamente, cerca de metade do número de gerações é exigido por backcross assistido marcador, ou speed congenics.Para a reprodução máxima, cruze os ratos para uma estirpe ultrapassada como o CD1. Os ratos CD1 foram derivados de ratos suíços, têm um alto grau de variação genética e foram selecionados para reprodução robusta.

células ES com alelos condicionais de EUCOMM
cada linha celular de EUCOMM irá requerer que você complete um contrato de transferência de materiais. Inicie este processo o mais cedo possível.
o tempo de geração dos ratos e o número de cruzamentos necessários para gerar os ratos experimentais combinam-se com um período de tempo que é surpreendente para aqueles que não são usados na genética do rato, então planeie com antecedência. O tempo de geração de ratos (o tempo entre adultos sexualmente maduros e descendentes sexualmente maduros) é de cerca de 3 meses.
os alelos condicionais da EUCOMM tipicamente têm uma cassete flanqueada com Frt (uma cassete” Frt-ed”). A cassete tem um aceitador de splice que desvia praticamente todos os splicing para a cassete, tornando o alelo uma mutação de perda de função nesta configuração. Para gerar o alelo condicional, a cassete flanqueada por Frt precisa ser removida atravessando para ratos que expressam Flpe. O sistema Flpe/Frt é comparável, mas distinto do sistema Cre / LoxP.Vamos injectar as células ES em embriões hospedeiros para fazer ratos quiméricos. A partir daí, você criará os ratos para gerar ratos que transportam a mutação (transmissão germinal). Esta geração fundadora de ratos pode ser cruzada para ratos que expressam Flpe para remover a cassete Frt-ed, gerando o alelo condicional. Então, você precisa fazer mais várias cruzes para gerar os ratos experimentais.

1. da injecção de células ES para Quimeras adultas sexualmente maduras é o tempo de geração de ratinhos (3 meses).
2. as quimeras são criadas em ratos de tipo selvagem para estabelecer o mutante na linha germinal (3 meses).
3. the heterozygous frtd conditional mice are crossed to Flpe expressing homozygotes. Isto gera flpe/ o, frtd condicional / + descendentes. (3 meses)
4. o Flpe/o, frtd condicional/+ ratinhos são cruzados para o tipo selvagem para estabelecer o alelo excisado na linha germinal e afastar Flpe, e a excisão é verificada molecular nestes ratinhos condicionais/+ (3 meses).
5. o ratinho condicional/+ foi criado um para o outro para fazer ratos alelos condicionais homozigóticos (3 meses).
6. os ratinhos condicionais / condicionais são criados em ratinhos CRE/CRE específicos aos tecidos específicos aos tecidos, null/+ ratinhos para tornar o CRE/o específico aos tecidos experimentais, ratinhos condicionais/nulos, e ratinhos CRE/o específicos aos tecidos de controlo, ratinhos condicionais/+.

além disso, é necessário obter o ratinho pple, null, Cre, o ratinho específico do tecido-Cre/tissue-specific-Cre, null/+.
também, o alelo condicional deve ser analisado para determinar se é tipo selvagem na função antes da excisão com Cre, e nulo após a excisão com Cre. Para determinar se o alelo condicional é de tipo selvagem na função antes da excisão, mutantes condicionais/condicionais e condicionais/nulos devem ser examinados para determinar se o seu fenótipo é o mesmo que os ratos +/+ e null/+ respectivamente. Para determinar se o Cre-excisados condicional é um alelo nulo o condicional é cruzado com uma linha germinativa Cre mouse e o excisados condicionais são intercrossed para testar se o fenótipo de excisados condicional/excisados condicional é o mesmo como null/null e/ou que nenhuma proteína é feita a partir da excisados condicional alelo.
um repórter da actividade Cre como o RosaReporter, ou mais idealmente, mostrando directamente que a proteína de interesse está ausente das células alvo por imunofluorescência é um controlo importante. O RosaReporter gera expressão beta-galactosidase permanente em todas as células que foram expostas ao Cre.
a expressão Cre excessiva pode levar a uma quebra cromossómica que pode causar fenótipos não relacionados com a função do alelo condicional. Portanto, ratos irmãos que expressam Cre mas retêm alguma função genética (por exemplo, condicional/+) são um controle importante.