materiais e métodos
após receber o consentimento informado por escrito das doentes, examinámos a farmacocinética no estado estacionário da clonidina no plasma administrada por via oral a 17 mulheres grávidas a receber clonidina durante meados da gravidez (22-26 semanas de gestação) ou no final da gravidez (34-38 semanas de gestação). Seis destas mulheres participaram em colecções de amostras de plasma maternas e umbilicais (arteriais e venosos) no momento do parto para medição das concentrações de clonidina. A idade gestacional foi baseada no último período menstrual ou no início da datação por ultrassom.
Selecção De Assuntos. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão investigacional da Universidade de Washington. Os indivíduos eram elegíveis para participar se estivessem grávidas, com 18 anos de idade, tivessem um hematócrito ≥28%, e estivessem a receber clonidina oral para hipertensão materna.
Regime Posológico. A terapêutica com clonidina por via Oral não foi alterada para efeitos do estudo. As doses variaram entre 0, 15 e 0, 30 mg por dia, administradas em doses divididas. A duração do estudo farmacocinético foi dependente do intervalo posológico do indivíduo, que variou de 6 a 12 horas durante 3 dias antes do estudo, foram fornecidos comprimidos de clonidina oral, do mesmo lote de fabrico. Os indivíduos registaram a hora de cada dose num calendário de estudo. Os indivíduos tomaram a sua dose matinal de clonidina no espaço de 30 min às 8: 00. As doses subsequentes foram tomadas no período de 30 minutos após a administração programada. Na manhã do estudo farmacocinético, os indivíduos foram convidados a jejuar, com excepção de líquidos límpidos, 5 h antes da administração de clonidina até 1 h após a administração.
Recolha De Amostras. As amostras de plasma em série foram recolhidas nas seguintes alturas:: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, e 12 horas após a administração, ou truncadas de modo a corresponderem ao intervalo posológico do sujeito. A urina foi recolhida ao longo de um intervalo posológico para determinar a depuração renal da clonidina e a depuração da creatinina. No momento do parto, foram colhidas amostras de Plasma, do cordão materno e umbilical (arterial e venoso), para quantificar as concentrações de clonidina. Todas as amostras foram armazenadas a -80°C até à análise das amostras.Concentrações De Clonidina
As concentrações plasmáticas de clonidina foram quantificadas utilizando um ensaio validado de cromatografia líquida/espectrometria de massa (CL/MS). Em breve, 250 µl das amostras de plasma foi misturado com 500 pg de padrão interno (clonidina-d4) em 500 µl de carbonato de sódio (0,1 M) (pH = 9.3) e 3 ml de heptano/isoamyl álcool (98.5:1.5). Os padrões foram preparados pela adição de plasma em branco com 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, e 750 pg de clonidina. As amostras foram agitadas num agitador horizontal durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação (1500g durante 10 minutos), as amostras foram congeladas em gelo seco e a camada orgânica decantada para um tubo de cultura limpo. Dois mililitros de alíquotas de ácido sulfúrico (0,05 M) foram adicionados à camada orgânica e novamente agitados durante 15 minutos. Após a centrifugação (1500g durante 10 minutos), as amostras foram congeladas em gelo seco e a camada orgânica foi descartada. Uma alíquota de 200 µl de 29.29% de hidróxido de amónio aquoso foi adicionado à camada aquosa juntamente com 3 ml de heptano/álcool isoamílico (98, 5:1, 5) e agitado durante 15 minutos. Após a centrifugação (1500g durante 10 minutos), as amostras foram congeladas em gelo seco e a camada orgânica decantada para um tubo de cultura limpo. A camada orgânica evaporou-se sob uma corrente de azoto a 40°C. O resíduo foi reconstituído com 75 µl de ácido fórmico (12 mM)/metanol (60:40), 10 µl dos quais foram injectados no sistema CL/MS.Foram misturadas amostras de urina
de 250 µl com 250 µl de ácido fórmico (12 mM) e 50 ng de padrão interno (clonidina-d4). Os padrões foram preparados pela adição de urina em branco com 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, e 25 ng de clonidina, respectivamente. As amostras foram indexadas, e 1 µl foi injetado no LC/MS.
o sistema LC/MS foi um Agilente 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) consistindo de bomba binária, auto-amostrador, compartimento de coluna e espectrômetro de massa. A coluna de cromatografia líquida de alta resolução era uma Phenomenex Synergi Polar RP80A, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Fenomenex, Torrance, CA). A coluna foi mantida a 40 ° C. os Componentes da fase móvel eram ácido fórmico de 12 mM (a) e metanol (B), com um caudal inicial de 0, 25 ml/min. A fase móvel inicial foi mantida durante 1 minuto e consistiu em 40% B para as amostras de plasma e 35% B para as amostras de urina. A percentagem de B foi aumentada linearmente durante os 4 minutos seguintes a 90% para o plasma e 60% para a urina, mantendo-se então constante durante 1 min, com um aumento linear do fluxo para 0, 3 ml/min para a urina e o plasma. Para o gradiente de retorno, a percentagem de B foi então diminuída linearmente durante 1 min a 40% (plasma) ou 35% (urina), que foi então mantida constante. O caudal foi mantido a 0, 3 ml/min durante 1 minuto e depois diminuiu linearmente durante 1 minuto para 0, 25 ml/min e manteve-se constante. O tempo total de execução foi de 12,5 minutos. Tanto para os ensaios de plasma como de urina, o espectrómetro de massa foi operado no modo electrospray positivo e definido para a monitorização selectiva dos iões m/z 230 (clonidina) e m/z 236 (clonidina-d4), com um tempo de permanência de 289 mseg para cada ião.Parâmetros Farmacocinéticos
Os parâmetros farmacocinéticos em estado estacionário foram determinados utilizando técnicas não-sectoriais padrão. A área sob a curva concentração-tempo da clonidina plasmática durante um intervalo posológico (AUCt) foi calculada utilizando a regra trapezoidal linear. A depuração oral aparente (CL/F) foi calculada por CL/F = Dose/AUCt. A depuração renal da clonidina (CLrenal) foi calculada por CLrenal = Ae,τ/AUCt, em que Ae,τ = a quantidade de clonidina excretada inalterada na urina ao longo de um intervalo de administração. A depuração da creatinina foi calculada por ClCr = (Volumeurina × creatina)/(Creatineserum× τ). A depuração renal da clonidina ajustada para a taxa de filtração glomerular (TFG) foi calculada por CLrenal ajustada para TFG = CLrenal – fu × CrCl, em que se presumiu que a fracção não ligada no plasma (fu) era de 0, 80 (Hulter et al., 1979). Em todos os nossos assuntos, o relativamente curto intervalo entre as doses administradas não permitir a estimativa precisa de clonidine meia-vida, que tem sido relatada para ser 11.1 ± 3.3 e 10,8 ± 2.2 h em nonpregnant adultos saudáveis (Cunningham et al., 1994; Fujimura et al., 1994).
Statistics. Os parâmetros farmacocinéticos da clonidina durante a gravidez foram comparados com parâmetros previamente publicados em voluntários saudáveis e não grávidas (CL/F, Porchet et al., 1992; Cunningham et al., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). Foi utilizada regressão Linear para determinar a correlação entre a depuração da creatinina e a depuração renal da clonidina. O teste t de estudante não emparelhado foi usado para comparar os grupos grávidas e não grávidas. Um valor p <0, 05 foi considerado significativo. Todos os resultados são reportados como média ± D. P.