discussão
adulto C. sinensis vermes que foram incubados em meio de caldo produziram mais de 4.000 ovos/verme/dia no início. A partir daí, a contagem de ovos diminuiu para um pouco acima de 1.000 no dia 7, e para 300-400 no dia 14. As contagens tornaram-se inferiores a 100 aos 28 dias na mídia de caldo. As contagens eram semelhantes entre três mídias de caldo. Ao contrário disso, as contagens na alma de Locke eram de 220±44 e 1023±64 no dia 1 e 3, respectivamente. Estas contagens eram menores do que as dos caldos no início, mas os vermes produziram mais ovos no dia 21 e mais tarde. Os vermes em meio de caldo produziram seus ovos mais vigorosamente na fase inicial da incubação, enquanto aqueles na solução de Locke produziam menos ovos diariamente, mas por um período mais longo. As contagens diárias de ovos de 4.000 por um verme adulto eram compatíveis com o número médio estimado de 3.770 ovos de um humano infectado .Com base na contagem dos ovos, o total de ovos produzidos por um verme adulto incubado, que foi recuperado de coelhos após 8 semanas de infecção, foi estimado em 37.274±2.988, em média. Estas contagens totais de ovos foram semelhantes independentemente da solução de cultivo ou mídia. A contagem diária de óvulos diminuiu rapidamente e o útero ficou vazio durante o cultivo. Por conseguinte, a actual contagem diária de óvulos representava que os vermes cultivados in vitro produziam apenas os ovos intra-uterinos que eram pré-formados no seu útero enquanto viviam em coelhos antes do cultivo. Com base nos dados, estima-se que uma gravid C. sinensis contém cerca de 37.000 ovos em seu útero e produz cerca de 4.000 ovos por dia. Assim, os ovos podem permanecer no útero cerca de 10 dias para a maturação intra-uterina. A maioria dos ovos no útero foram encontrados maduros e o miracídio já se desenvolveu, mas alguns deles eram imaturos principalmente no útero proximal. Esses ovos imaturos não se desenvolveram mais durante o cultivo. Estes achados sugerem que os vermes cultivados são incapazes de formular novos ovos viáveis e maturação de ovos imaturos pré-formados também é impossível pelo cultivo in vitro.
C. os ovos de sinensis variam entre 28-31×13-16 µm de tamanho, tendo um operículo na sua extremidade cónica e um pequeno botão abopercular . No presente estudo, os ovos expelidos mostraram um contorno anormal à medida que o verme sobreviveu mais tempo. O comprimento médio do ovo foi reduzido gradualmente e significativamente na solução de Locke (27,49±0,48 µm) e em todos os caldos. A redução do comprimento resultou na redução do valor do FMI. O IMC foi proposto como um parâmetro para a análise biométrica para aproximar o volume de ovos para fluídos heterofíidos e opisthorchiidos . Na presente investigação, os valores do FMI diminuíram no dia 60 na solução de Locke e no dia 90 na mídia de caldo. A diminuição dos valores de IMC sugere redução do volume de ovos por retracção do comprimento e degeneração do conteúdo. A maioria dos ovos produzidos após 60 dias de cultivo in vitro foram deformados, e sua relação comprimento/largura foi inferior a 1,7 e o valor do FMI foi inferior a 7.000. A maioria desses ovos eram considerados inviáveis quando manchados com azul de tripan. O cultivo por 60 dias pode ser o período máximo de viabilidade dos ovos.
a observação microscópica da luz revelou acumulação de vacúolos e massas escuras dentro da casca do ovo, uma vez que o cultivo durou mais de 60 dias. Os vacúolos e as massas escuras pareciam ser células vitelinas deformadas, como mostrado em O. viverrini . Esses materiais nos ovos sugeriram que as células vitelinas ou outros materiais de formação de ovos foram degenerados e os ovos foram abortados. Os ovos maduros que formam o miracídio podem sobreviver por muito tempo, mas os abortados não. A degeneração dos materiais internos pode ter induzido deformidade e redução do volume dos ovos. Um estudo encontrou ovos deformados quando adultos maduros de Equinostoma caproni gravid armazenados na solução de Locke até 4 meses a 4 ° C. Uma possível explicação para as alterações acima pode ser a curtimenta inadequada da quinona, que está associada ao processo de formação da casca do ovo . O cultivo in vitro a longo prazo pode ter afectado este processo enzimático mediado pela fenol-oxidase, resultando numa casca deformada do ovo . Assim, o cultivo in vitro prolongado de C. sinensis pode deformar os ovos, bem como a sua viabilidade.
os ovos maduros de C. sinensis contêm um manípulo abopercular muito discreto. O. viverrini, um Fluco hepático estreitamente relacionado, também mostra um manípulo abopercular muito pequeno a ligeiramente desenvolvido dos ovos . No presente estudo, o botão abopercular da casca do ovo tornou-se mais proeminente na maioria dos ovos após 60 dias de incubação. A aparência de um botão abopercular tão proeminente era óbvia na maioria dos ovos degenerados. Krejci e Fried demonstraram que o manípulo abopercular pode ser superficial ou profundamente impregnado na casca do ovo no caso de Echinostoma caproni e E. trivolvis, respectivamente. No presente estudo não foi observada a formação de um manípulo abopercular em torno da concha. O proeminente manípulo abopercular pode ser uma extensão do manípulo normal existente em resposta à mudança fisiológica de vermes moribundos. Em conjunto, é difícil para os flukes produzir ovos viáveis normais através do cultivo in vitro.
a estrutura superficial dos ovos, observada por SEM, parecia ser uma característica morfológica adequada para compreender o estado da casca do ovo. Entre os opisthorchiids, a superfície do ovo de C. sinensis é extremamente esculpida para fazer rugas entrelaçadas de altura variável, o que ajuda a capacidade de acumular fibras aquáticas naturais e aumentar a possibilidade de contato com hospedeiros moluscanos . No presente estudo, observou-se uma diminuição da rugosidade da superfície por SEM dos ovos abortados. Esta diminuição de rugas com o proeminente botão abopercular pode ser resultado de um processo degenerador da casca do ovo.
o presente estudo teve algumas limitações. Não havia dados diretos da viabilidade do ovo para comparar com mudanças morfológicas. A eclosão in vitro de ovos pode dar informações precisas sobre a viabilidade dos ovos, mas a dos ovos de C. sinensis ainda não é possível. Também os dados da morfologia e fisiologia dos vermes incubados eram limitados.
em conclusão, o cultivado C. os vermes sinensis em meio de caldo passam ovos viáveis durante 60 dias que são pré-formados no útero durante a sua sobrevivência em coelhos. Os ovos imaturos pré-formados são incapazes de desenvolver miracídio por cultivo in vitro. Um adulto adulto C. sinensis contém cerca de 37.000 ovos no útero e produz cerca de 4.000 ovos por dia. Os ovos deformados do valor do IMC inferior a 7.000 e relação comprimento / largura inferior a 1,7 não são viáveis.