até agora, em nossa série de plasmídeos 101, temos trabalhado nosso caminho através do mapa plasmídeo: resistência a antibióticos, origem da replicação, e assim por diante. Até este ponto podemos replicar nosso plasmídeo e garantir que as células o mantenham; o próximo passo é conseguir que o plasmídeo expresse nosso gene de interesse. Introduza o promotor, o elemento responsável por iniciar a transcrição da sua inserção no RNA.
na prática, o termo “promotor” descreve a combinação do promotor (local de ligação da ARN-polimerase) com operadores (elementos de resposta). Os promotores têm cerca de 100 a 1000 pares de base de comprimento e são encontrados a montante dos seus genes-alvo. A sequência da região promotora controla a ligação da ARN polimerase e os factores de transcrição, pelo que os promotores desempenham um papel importante na determinação de onde e quando o seu gene de interesse será expresso.
A(S) ARN polimerase (s)
ARN é transcrita a partir do ADN usando uma ARN polimerase (RNAP). Em bactérias isto é feito por uma única enzima; no entanto, eucariontes têm polimerases muliple que são cada um responsável por um subconjunto específico de RNAs. Para obter esta especificidade, o RNAP eucariótico pode reconhecer e ligar-se a elementos promotores específicos. Isto significa que o promotor presente na sua espinha dorsal plasmídica deve ser compatível com o tipo de ARN que precisa de ser feito: se você quer mRNA (para expressão genética), você precisa usar um promotor RNAP II, enquanto pequenas RNAs (como shRNA) são transcritas a partir dos promotores RNAP III. Este post apresenta promotores para a transcrição geral RNAP II e RNAP III; no entanto, usando LTRs virais como promotores RNAP II é comumente empregado em construções lentivirais e retrovirais e vamos discuti-los em um futuro post sobre partes vectoras virais.
especificidade de Promotor
para além de escolher um promotor baseado no tipo de transcrição de ARN, terá também de se certificar de que o seu plasmídeo tem um promotor adequado para trabalhar no organismo hospedeiro. Uma vez que as máquinas de transcrição diferem entre tipos de células ou organismos, os promotores devem ser igualmente variáveis. Os promotores bacterianos só trabalham em células procarióticas e tipicamente apenas nas mesmas espécies ou espécies estreitamente relacionadas das quais foram derivadas. Do mesmo modo, os vários tipos de células eucarióticas (mamíferos, leveduras, plantas, etc.) exigem promotores únicos e há muito pouco cruzamento. De um modo geral, os promotores das bactérias são menos diversos e complexos, tendo menos partes do que as das células eucarióticas. Alguns promotores são constitucionalmente activos e constantemente, enquanto outros são mais cuidadosamente controlados. Promotores regulados podem agir apenas em certos tecidos ou em determinados momentos de desenvolvimento ou pode haver maneiras de ligá-los ou desligá-los à vontade com um químico, calor ou luz. Na célula, os promotores são controlados por outros fatores regulatórios: potenciadores, elementos de contorno, isoladores e silenciadores; no entanto, alguma “fuga” de transcrição pode ocorrer. Este normalmente não é um grande problema para as células, mas pode confundir os resultados da pesquisa ou até mesmo matar suas células se o seu gene de interesse é tóxico. Para combater isso, os cientistas criaram promotores sintéticos, que normalmente incluem alguma combinação de outros elementos promotores, e tendem a ser mais bem regulados.
promotores comuns para eucariotas e procariotas
incluímos duas tabelas de referência abaixo listando alguns dos promotores mais comuns de bactérias e mamíferos. Estas listas não são de modo algum exaustivas, mas deve ser um bom lugar para começar ao tentar escolher o seu promotor perfeito!
Promotores Eucarióticos
| Promotor | usado Principalmente para | RNA transcrito de | Descrição | a Expressão | considerações Adicionais |
| CMV | expressão Geral | mRNA | Forte expressão de mamífero, o promotor de citomegalovírus humano | Constitutivo | Pode conter um potenciador região. Pode ser silenciado em alguns tipos de células. |
| EF1a | expressão Geral | mRNA | Forte expressão de mamífero a partir de humano, fator de alongamento 1 alfa | Constitutivo | Tende a dar expressão consistente, independentemente do tipo de célula ou fisiologia. |
| SV40 | expressão Geral | mRNA | expressão de Mamífero, o promotor da símia vacuolating vírus 40 | Constitutivo | Pode incluir um enhancer. |
| pgk1 (humano ou rato) | expressão geral | mRNA | promotor de mamíferos do gene da cinase fosfoglicerato. | Constituinte | expressão generalizada, mas pode variar por tipo de célula. Tende a resistir à regulação do promotor por metilação ou desacetilação. |
| Ubc | expressão Geral | mRNA | Mamíferos promotor do humano hidrolase C gene | Constitutivo | Como o nome indica, este promotor é onipresente. |
| humanos beta actina | expressão Geral | mRNA | Mamíferos promotor de beta-actina de genes | Constitutivo | Onipresente. Chicken version é comumente usado em híbridos promotores. |
| CAG | expressão Geral | mRNA | Forte híbridos mamíferos promotor | Constitutivo | Contém CMV enhancer, frango beta actina promotor, e coelho beta-globina emenda acceptor. |
| TRE | expressão geral | mRNA | promotor do elemento de Resposta da tetraciclina | indutível com Tetracilina ou seus derivados. | normalmente contém um promotor mínimo com baixa actividade basal e vários operadores de tetraciclinas. A transcrição pode ser ligada ou desligada, dependendo do que é utilizado o transativador de tet. |
| UAS | expressão Geral | mRNA | Drosophila promotor conaining Gal4 sítios de ligação | Específico | Requer a presença do gene Gal4 para ativar o promotor. |
| Ac5 | expressão Geral | mRNA | Forte de insetos promotor de Drosophila Actina 5c gene | Constitutivo | Comumente utilizado em sistemas de expressão de Drosophila. |
| Polyhedrin | expressão Geral | mRNA | Forte de insetos promotor de baculovirus | Constitutivo | Comumente utilizado em sistemas de expressão para células de inseto. |
| CaMKIIa | a expressão do Gene para optogenetics | mRNA | Ca2+/calmodulin dependente da proteína quinase II promotor | Específico | Usado para neuronal/CNS expressão. Modulada pelo cálcio e pela calmodulina. |
| GAL1, 10 | expressão Geral | mRNA | Levedura adjacentes, de forma divergente transcrita promotores | inflamação induzida por com galactose; repressible com glicose | Pode ser usado de forma independente ou em conjunto. Regulado por GAL4 e GAL 80. |
| TEF1 | expressão Geral | mRNA | Levedura da transcrição do fator de alongamento promotor | Constitutivo | Análoga à de mamíferos EF1a promotor. |
| GDS | expressão Geral | mRNA | Forte de fermento expressão promotor de glyceraldehyde 3-phosphage desidrogenase | Constitutivo | Muito forte, também chamada de TDH3 ou GAPDH. |
| ADH1 | expressão Geral | mRNA | Levedura promotor de álcool desidrogenase I | Reprimida por etanol | versão Completa é forte, com alta expressão. Promotores truncados são constitutivos com expressão inferior. |
| CaMV35S | expressão Geral | mRNA | planta Forte promotor do Vírus do Mosaico da Couve-flor | Constitutivo | Ativo em dicots, menos ativo na monocots, com alguma atividade em células de animais. |
| Ubi | expressão Geral | mRNA | Planta promotor de milho hidrolase gene | Constitutivo | Dá alta expressão em plantas. |
| H1 | pequeno RNA expressão | shRNA | do humano polimerase III RNA promotor | Constitutivo | Pode ter um pouco menor expressão do que U6. Pode ter melhor expressão nas células neuronais. |
| U6 | pequeno RNA expressão | shRNA | do humano U6 pequeno nuclear promotor | Constitutivo | Murino U6 também é usado, mas pode ser menos eficiente. |
Procariontes promotores
| Promotor | usado Principalmente para | Descrição | a Expressão | considerações Adicionais |
| T7 | transcrição in vitro/ expressão geral | Promotor de bacteriófago T7 | Constitutivo, mas requer T7 RNA polimerase. | quando usado para transcrição in vitro, o promotor conduz a transcrição sensorial ou antisense dependendo da sua orientação para o seu gene. |
| T7lac | níveis elevados de expressão genética | Promotor de bacteriofagem T7 mais operadores de lac | expressão basal negligenciável quando não induzida. Requer RNA polimerase T7, que também é controlada pelo operador lac. Pode ser induzido pela IPTG. | comumente encontrado em vetores pET. Muito bem regulado pelos operadores da lac. É bom para modular a expressão genética através de concentrações variadas de indutores. |
| Sp6 | transcrição in vitro/ expressão geral | Promotor do Sp6 bacteriófago | Constitutivo, mas requer SP6 RNA polimerase. | SP6 polimerase tem uma elevada processividade. Quando usado para transcrição in vitro, o promotor conduz a transcrição sensorial ou antissense dependendo da sua orientação para o seu gene. |
| araBAD | expressão Geral | Promotor de arabinose metabólica operon | inflamação induzida por por arabinose e reprimida catabolite repressão na presença de glicose ou por concurso de vinculação do anti-indutor fucose | mais Fraco. Comumente encontrado em vetores pBAD. Bom para regulação rápida e expressão basal baixa; no entanto, não é adequado para modular a expressão genética através de concentrações variadas de indutores. |
| TRP | elevados níveis de expressão genética | Promotor de E. o operão de coli triptofano | repressivo | é desligado com níveis elevados de triptofano celular. |
| lac | expressão Geral | Promotor do operon lac | Constitutivo, na ausência de repressor lac (lacI ou lacIq). Pode ser induzida por IPTG ou lactose. | promotor com expressão ligeiramente fraca. a mutação de lacIq aumenta a expressão do compressor 10x, apertando assim a regulação do promotor de lac. É bom para modular a expressão genética através de concentrações variadas de indutores. |
| Ptac | expressão Geral | Híbrido promotor de lac e trp | Regulamentado como o promotor lac | Contém -35 região de trpB e -10 região da alc. Regulamentação muito apertada. É bom para modular a expressão genética através de concentrações variadas de indutores. Geralmente é melhor expressão do que apenas laceração. |
| pL | Altos níveis de expressão do gene | Promotor de bacteriófago lambda | Pode ser temperatura regulatable | muitas Vezes emparelhado com o sensível à temperatura cI857 repressor. |
| T3 | transcrição in vitro/expressão geral | Promotor de T3 bacteriófago | Constitutivo, mas requer T3 RNA polimerase | Quando utilizado para transcrição in vitro, o promotor unidades o senso OU anti-senso transcrição dependendo de sua orientação para o gene |
Embora esta lista é um ótimo lugar para começar, as tabelas acima não mergulhar o tecido ou desenvolvimento específico de promotores disponíveis para os cientistas. Os plasmídeos são muitas vezes utilizados para fins terapêuticos, e nesses casos é importante identificar os promotores específicos do tecido certo, como descrito pelos pesquisadores do NIH aqui.Nota: A. Max Juchheim contribuiu para a redacção deste artigo.