O papel de chordin/Bmp sinais de mamíferos da faringe desenvolvimento e síndrome de DiGeorge | Desenvolvimento

RESULTADOS

Gastrulation defeitos em Chrd-/- ratos

A Chrd secretado Bmp-proteína de ligação é expressa no mouse o nó de andits derivados, notocorda e da faringe endoderm(Fig. 1A-F). Os proteinconta quatro domínios ricos em cisteína (CR), todos os quais são capazes de ligar Bmps.CR1 e CR3 mostram a maior afinidade para Bmp4, e pode antagonizar sinais Bmp após a injecção de mRNA em embriões de Xenopus(Larrain et al., 2000). Toogenerate a null allele of Chrd, we prepared a targeting constructt with translation stop codons in the three possible reading frames within thesignal peptide region. Os codões de paragem foram seguidos por um “frameshift” e pelo esforço, após o CR1, de cassetes IRES-lacZ e PGK-neo que ainda mais romperam o gene CRD (Fig.1G). Transcrições deste Alelo Chrdtm1DR(a seguir designado por CRD-) não detectáveis em embriões inChrd-/- na fase de nó (Fig. 1J, arrowhead).

Heterozigotos Chrd ratos eram viáveis e férteis e foram acoplados togenerate Chrd-/- embriões de vários estágios de desenvolvimento.No dia E8.5, observou-se a presença de reabsorção nódulos no útero ofpregnant fêmeas e uma pequena redução no número esperado ofChrd-/- embriões (50 recuperado, 57 esperado). Quatro embriões homozigóticos de mutantes homozigóticos revelaram uma clara redução do tamanho da região embrionária, acompanhada por um alargamento dos alantois em relação ao resto do embrião (Fig.2A, A’). Em seções histológicas, uma considerável hipoplasia da placa neural (Fig.2B, B’), ausência de somites e de notochord (Fig. 2C, C’), e anabundância de células mesodérmicas extra-embrionárias nos alantois(Fig. 2D, D’) foram observados. O resto dos mutantes (46) eram morfologicamente indistinguíveis dos seus companheiros heterozigóticos e selvagens. O fenótipo dos mutantes de fourbanormal era semelhante, mas menos pronunciado do que, a ventralização do mesoderme observado em CRD homozigous Duplo;Nogmutantes (Bachiller et al.,2000) em que, além disso, também estavam presentes as truncações anteriores do neuralplato.

in Zebrafish and Xenopus, inactivation of Chrd causes anexpansion of ventral mesoderm and reduction of dorsal mesoderm and neuralplate (Schulte-Merker et al.,1997). Nos mamíferos, o mesoderme forma-se durante a gastrulação pela compressão das células epiblastas através da sequência primitiva. Células que saem no final posterior da sequência primitiva movem-se para a região extra-embrionária, onde dão origem a uma linhagem mesodérmica (alantois, amnião e ilhas do saco yolk) equivalente ao mesodermio ventral dexenopus. Por outro lado, as células localizadas em regiões mais anteriores da semeadura permanecem dentro do embrião propriamente dito e produzem o mesoderme paraxial, intermediário e lateral da placa do tronco futuro. O fenótipo precoce dos mutações DRD, no qual o alantois é expandido no expenso do mesoderme embrionário, é consistente com uma ventralização precoce do embrião do rato. Este fenótipo deve levar à morte dos animais afectos, uma vez que nenhum mutante homozigótico com alantois anómalo foi recuperado de fissuras em fases posteriores. A análise deste fenótipo com marcadores moleculares não foi realizada porque foram obtidos tão poucos embriões anormais.

letalidade Perinatal

apenas 49% (95 de 194) dos CRD-/-animais esperados foram recuperados ao Nascimento, Todos mostrando o mesmo fenótipo penetrante. Destes, a maioria era nado-morto,mas alguns tentaram, sem sucesso, inflar seus pulmões. Externamente, os recém-nascidos mutantes homozigóticos eram ligeiramente menores do que os seus ninhadas de tipo selvagem e apresentavam cianose,microcefalia e redução do ouvido externo, que foi fixado anormalmente próximo do olho (Fig. 3A”).Exame histológico (Fig.3B’ – C’) revelou a falta de timo (t, um derivado da terceira bolsa faríngea) e palato secundário (p), e hipoplasia da orelha interna (ie) nos mutantes. O lóbulo anterior e o pars intermedia da glândula hipófise (pi), ambos derivados do ectodermo oral dorsal imediatamente adjacente à borda cefárica do endoderme anterior, eram normais(Fig. 3C, C’). Isto definiu o limite rostral do fenótipo na orofaringe, commalformações restritas a derivados do endodermia expressivo de CRD. A glândula tiroideia, que se forma na endodermia ventral faríngea no teforamen caecum, diferenciava mas era hipoplástica e de forma irregular(th, Fig. 3C’). As glândulas paratiróides, derivados das bolsas faríngeas 3 e 4, estavam ausentes(dados não demonstrados), uma observação consistente com a hipocalcaemiasina neonatal em indivíduos com síndrome de DiGeorge(DiGeorge, 1968). Concluímos que o fenótipo de ratos CRD – / – nado-mortos recapitulatesmaior das características descritas em tais indivíduos.

defeitos esqueléticos

em preparações esqueléticas de animais CRD/ recém-nascidos, os ossos apendicular e lombar eram normais, mas a base do crânio e o esqueleto axial anterior apresentavam múltiplos defeitos. As alterações no osso emporal incluíram a falta do squama temporalis (st) e o encurtamento do arco zigomático (Fig.4A, A’). Observamos também uma considerável hipoplasia do osso tioídeo e das cartilagens da tiróide e da laríngea cricóide(Fig. 4B’), e uma mandíbula anormalmente pequena (Fig.4C’). Na base do crânio, a alisfenóide (as)parecia normal, mas na linha média os ossos basioccipital (bo) e basisfenóide(bs) foram fundidos, e o presphenóide (ps) foi hipoplástico(Fig. 4D, D’). Consistent with the histological findings, the palatine shelvs failed to extend medially to form the secondary palate. No ouvido, o anel timpânico e a capsula otica foram reduzidos e malformados(Fig.4D’). Observaram-se também malformações esqueléticas nas regiões cervicais e torácicas da coluna vertebral. Os corpos vertebrais(vb) eram mais pequenos em crod-/- neonatos (Fig. 4E’), com delayedossificação e perda ocasional de outros elementos das vértebras tais processos asspínicos, arcos neurais e o arco anterior do atlas(Fig. 4E ‘ andFig. 5A”).

os defeitos esqueléticos dos mutantes CRD já eram detectáveis condensações de incartilagem em E14. 5 (Fig.5A, A’). As cartilagens basioccipital e basisfenóide foram fundidas, e o centro de ossificação do basioccipital foi mais estreito e estendido para o basisfenóide (Fig.5B, B’). O notochord anterior, que estava presente na linha temática do basioccipital de tipo selvagem, estava ausente em mutantes CRD(Fig. 5B, B’). A ausência de um notóforo anterior foi confirmada por exame histológico da região clínica em E14. 5 (Fig.5F’).

os ossos afectados pela mutação CRD têm origens muito diferentes. O basioccipital é puramente de origem somítica; partes do basisfenóide surgem a partir da ossificação endocondral do mesenchyme cefálico; a Salatina se origina da ossificação intramembranosa da crista neural-derivedmesenchyme; as cápsulas Oticas diferenciam-se de uma mistura de células da crista neural da mesodérmica paraxial; e o hióide é uma crista estritamente neural derivada(Le Douarin e Kalcheim,1999). Amid such diversity of lineages, the unifying principle of phenotype seems to be the location of malformed structures in theproximity of the Chrd-expressing axial mesendoderm(Fig. 1E). Esta interpretação é consistente com a degeneração prematura observada do acorde anteriornotocóforo em CRD-/- animais, e com a exigência de placas précordais e sinais derivados de mesendoderme para o desenvolvimento do esqueleto da cabeça (Belo et al.,1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

defeitos cardiovasculares Tipo DiGeorge

a cianose observada à nascença pode ser um sinal de mau funcionamento cardíaco. Para investigar esta questão, foram realizadas dissecções em diferentes fases de desenvolvimento embrionário. Na E14.5, Os corações de DRD – / – animais mostraram um único vaso, em vez de dois formais, no trato de saída cardíaca (Fig. 5D, D’, E, E’).Esta condição é conhecida no ser humano como trunco arterioso persistente e é malformação animportante em indivíduos com síndrome de DiGeorge. A falta de separação entre a aorta ascendente e o tronco pulmonar pode aumentar a carga de trabalho do ventrículo direito causando a sua hipertrofia, bem como a vasodilatação, edema e hemorragia observados nos embriões E14.5(Fig. 5C’). Como síndrome de inDiGeorge, defeitos no sistema cardiovascular estenderam-se para além do tracto outflow e incluíram os grandes vasos derivados das arcartérias faríngeas (Fig. 6). Nos mutantes de newbornChrd, as artérias carótidas comuns uniram-se directamente ao truncusartiosus, resultando na ausência da artéria braquiocefálica e de parte do arco aórtico (Fig. 6A-C).As artérias pulmonares originaram-se directamente do truncusartiosus proximal, resultando na ausência de um tronco pulmonar comum(Fig. 6A-C). Além disso, observaram-se defeitos de lateralidade, com uma viragem à direita anormal da aortain 40% dos mutantes (Fig. 6, compare 6Ewith 6F). Quando as dissecações foram realizadas a partir da parte posterior, pode ser visto que, dependendo da lateralidade da aorta descendente, as artérias subclávia direita ou esquerda adotaram uma retroesofágica anormal (Fig. 6D-F). Efeitos similares têm sido descritos em embriões de pintos com ablações de células de crista neural (Kirby et al.(1983), and inmice carrying deletions in the DiGeorge congenic region (Lindsay et al., 1999;Merscher et al., 2001) ormutations in Tbx1 and Fgf8(Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002;Jerome and Papaioannou, 2001;Lindsay et al., 2001;Vitelli et al., 2002b).

à nascença, apenas 49% dos mutantes homozigóticos CRD esperados foram descobertos. No entanto, 48 dos 56 (86%) embriões CRD/-ainda estavam vivos em ninhadas dissecadas em E14.5, uma frequência não significativamente diferente da observada em E8.5 (88%). O aumento acentuado da letalidade após o E14.5 coincide com a manifestação completa do fenótipo cardiovascular, e sugere que o mau funcionamento circulatório é uma causa importante da letalidade dos embriões CRD/ – durante a gestação.

Faringe anormalidades

Para determinar o início da faringe fenótipo nós dissecados pregnantfemales de heterozigotos cruzamentos em diferentes épocas post coitum. Na E9.0, a astagem em que o CRD é expresso no endodermia faríngea,os embriões CRD/ – podem ser identificados por uma marca na região do pescoço (Fig.7A’, arrow). As vesículas oóticas dos Mutantes foram reduzidas para metade do seu diâmetro normal(Fig.7A’, pontas de flechas) e o segundo arco (hióide) faríngeo estava desaparecendo. Os arcos faríngeos de três a seis nunca se formaram em embriões mutantes(Fig. 7B’ e dados notshown). As estruturas em falta ou malformadas são precursores diretos ou desempenham papéis indutivos durante o desenvolvimento de muitos dos órgãos que são eficazes ao nascer em ratos CRD -/ -. Como a maioria das anormalidades fenotípicas observadas em mutantes recém-nascidos têm a sua origem embriológica na endodermia faríngea e na região periférica, analisámos a expressão de um certo número de genes conhecidos por terem importantes desenvolvimentalroles na doença hereditária humana.

examinamos primeiro a expressão de Pax3, uma transcrição factorrexpressed em crista neural, tubo neural dorsal e somites (Goulding et al., 1991). Inumanos, PAX3 é mutado em doenças da crista neural designatedWaardenburg syndrome Type 1 and 3 (Strachan and Read, 1994) e é um co-regulador, juntamente com SOX10, do gene microphthalmia orMITF (Bondurand et al.,2000), o factor de transcrição sofreu uma mutação no síndrometype 2a de Waardenburg em humanos (Tassabehji et al.,1994). A mutação do Pax3 no rato splotch (Sp2H) resulta em defeitos cardíacos, incluindo o truncus arteriosus persistente, bem como malformações do timo, tiróide e glândulas paratiróides (Conway et al.,1997). Descobrimos que a expressão Pax3 era indistinguível entre embriões mutantes e de tipo selvagem Em E7.5 (não mostrado),mas em E10.5 foram observadas diferenças significativas. As células da crista Pax3-positiveneural que migram através dos arcos faríngeos 3, 4 e 6(Fig. 7C, pontas de flecha) foram claramente detectáveis em animais de CRD (Fig. 7C’). Estas células neuralcrest povoam o septo separando a aorta da artéria pulmonar no trato de saída, ou região conotruncal, do coração(Li et al., 2000). A falha da crista neural cardíaca para alcançar o coração explica a falta de tractseptação de saída e o fenótipo cardiovascular subsequente observado mutantes inchados. Curiosamente, a expressão de Pax3 em outros tecidos, como o componente mandibular (md) do primeiro arco faríngeo, dermomiótomos(dm) e precursores de mioblastos nos membros dianteiros (fl), não foi afetada(Fig. 7C’).A seguir, realizamos hibridizações in situ com Sox10, uma genemutada em indivíduos com síndrome de Waardenburg Tipo 4 (Pingault et al., 1998) isto é expresso em crista neural e células Schwann. Em E7. 5, a expressão desox10 era a mesma nos embriões CRD/ – e nos seus ninhado – tipo selvagem (dados não apresentados). Em E9.5, Sox10expression in the dorsal root ganglia(drg) of the trunk was normal (Fig. 7B, B’), mas a distribuição de células gliais que expressam Sox10 revelou efeitos específicos na organização do sistema nervoso periférico na região do pescoço e da cabeça dos mutantes (Fig.7B’). Em particular, os gânglios sensoriais cranianos mostraram normalidades marcadas. Os gânglios trigeminais (tr) e vestibulo-coclear (vc), correspondentes aos nervos cranianos V e VIII, respectivamente, foram localizados juntos em embriões CRD/ – do que em typelittermates selvagens. Além disso, foram observadas projecções nervosas anormais que ligavam as duas (Fig. 7B’, ponta de flecha). Os gânglios geniculados (g), petrosal (p) e nodose (n), correspondentes aos nervos cranianos VII, IX e X, foram os mais afetados, mostrando uma redução extrema no tamanho ou ausência completa. Estes três gangliaoriginate dos placodes epibranquiais, e são conhecidos por exigir indutivesignais de endodermia anterior para o seu desenvolvimento adequado(Begbie et al., 1999). A falta de gânglios derivados do placodo epibranquial indica que o proteinquérito segregado é necessário para a actividade do sinal indutivo liberado endoderme bifaríngeo.

Pax9 é um fator de transcrição necessário para o desenvolvimento do endoderma faríngeo e seus derivados no ratinho(Peters and Balling, 1999;Peters et al., 1998). Na E9.5, a expressão de Pax9 na endodermia faríngea do embrião-DRD / – foi mais fraca do que nos seus companheiros de tipo selvagem (pe, Fig.7D, D’). A expressão Pax9 revelou que o tamanho e o aspecto da faringe foram alterados nos mutantes CRD, com as faringelas reduzidas a um único inchaço na região anterior(Fig. 7E, E’). A teipoplasia da faringe foi confirmada por seções histológicas de E14. 5embryos, em que o endoderme anterior apareceu como um tubo fino delineando o lúmen agriamente diminuído (ph, Fig.5F, F’). A redução da endodermia faríngea também foi observada em knockdowns CRD Xenopus (Oelgeschläger et al.,2003). Regiões não faríngeas nas quais Pax9 mRNA é normalmente expressa, tais como os sclerotomas somíticos (sc) e mesenchyme facial(fm), não mostraram diferenças na distribuição ou abundância dos transcritos (Fig.7F, F’).

Podemos concluir, a partir desses estudos que as alterações no Pax3, Sox10 andPax9 expressão são restritas a uma área muito limitada, widerexpression domínios, sugerindo que a falta da proteína secretada Chrdspecifically interrompe local vias reguladoras atuando na peripharyngealregion circundantes a Chrd-expressando endoderm.A expressão de

Tbx1 e Fgf8 exige que a chordin

estude a interacção do CRD com genes conhecidos por causeDiGeorge ou fenótipos semelhantes a DiGeorge em ratinhos, analisamos a expressão do tbx1 e Fgf8 em embriões mutantes CRD. Tbx1 é um membro da família T-box de fatores de transcrição (Papaioannou e Silver,1998). Ele mapeia dentro do DGS / VCFS 22q11 microdeleção em seres humanos e recentemente tem sido mostrado para causar fenótipo Tipo DiGeorge em cima da inactivação em ratos (Jerome e Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). A expressão de Tbx1 foi alterada em embriões inChrd/. Em animais selvagens do tipo E7.5, a Tbx1is expressa na foregut (futura endodermia faríngea) e no mesoderme-de-cabeça(Fig. 8A). Nesta fase, os ninhadas mutantes mostraram uma clara redução nos níveis de expressão Tbx1 nas mesmas áreas (Fig.8A’). A redução do ARNm Tbx1 foi igualmente clara na região faríngea dos embriões homozigóticos CRD em E8. 0, E8. 5 ee9. 0 (Fig.8B”, C”, D”). Secções histológicas transversais mostraram que, a nível celular, a abundância de transcripts Tbx1 foi drasticamente reduzida em endodermia, tanto na faringe como na foreguta, até ao nível do divertículo hepático (Fig.8F-H’) A diminuição da concentração de Mrnawas Tbx1 também é evidente em mesoderme, incluindo cabeça, splanchnic (pontas de flecha) e mesodermomático(flechas) na região periférica (Fig.8F’, G’, H’). Além disso, Tbx1expression at E9 in the mesodermical core of the first pharyngeal arch wasdiffuse, extending to most of the arch, and Tbx1 transcripts wereabsent from the OIC vesicle (Fig.8D-D’).

Fgf8 é um fator de crescimento secretado expresso em uma variedade de tons, incluindo o endoderme faríngeo e mesoderme vizinho(Crossley e Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Durante o desenvolvimento precoce, o Fgf8 é necessário para a gastrulação (Sun et al., 1999) e o estabelecimento do eixo de simetria esquerda/direita(Meyers e Martin, 1999). Fases atlantes de Fgf8 é necessária para membros (Lewandoski et al., 2000;Moon and Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al.,1999) desenvolvimento. Experiências recentes demonstraram que os ratinhos com actividade reduzida do Fgf8 apresentam um espectro de defeitos cardiovasculares e faríngeos que imitam de perto a síndrome de DiGeorge(Abu-Issa et al., 2002;Frank et al., 2002). Além disso, a expressão Fgf8 é abolida na endodermia faríngea do tbx1-/- mutantes e ambos os genes interagem geneticamente durante a diferenciação das artérias do arco faríngeo(Vitelli et al., 2002b). AtE9, fgf8 expression in Chrd mutants is normal in themid-hindbrain isthmus, frontonasal prominence and tail. No entanto, na faringealendoderm, os níveis de transcrição Fgf8 são drasticamente reduzidos (Fig. 8E”). A redução da expressão Tbx1 e Fgf8 em embriões CRD/-sugere que ambos os genes actuam a jusante do CRD na Via sameregulatória. Estes experimentos não determinam se o Crdis é necessário para a manutenção ou para a indução do tbx1 andFgf8 na faringe e tecidos vizinhos.

para testar se o CRD pode induzir Tbx1 e Fgf8,injectámos mRNA CRD (50 pg) na região ventral de embriões dexenopus em quatro células. Explicantes da zona marginal Ventral (VMZ) foram dissecados em gastrula precoce, cultivados até o embrião-irmão atingir o estágio inicial de neurula, e analisados pela RTPCR. Os mRNAs Tbx1 e ffgf8 foram expressos em níveis elevados em embriões inteiros e explicantes da zona dorsalmarginal (DMZ) nesta fase, e em níveis baixos nos explicantes VMZ(Fig. 8I, lanes 1-3). Uponmicroinjection, CRD mRNA increased the levels of Tbx1 andFgf8 in VMZ(Fig. 8I, lane 4). A hibridização in situ de Xenopus microinjetados confirmou que as transcrições Tbx1 induzidas pelo mRNAwere CRD localizadas em endoderme faríngeo (dados não mostrados). Concluímos que o DRC, um antagonista Bmp, pode induzir a expressão Tbx1 e Fgf8 nos embriões de Xenopus, e é necessário para a plena expressão destes genes na região faríngea do embrião do rato.