O clivada-Caspase-3 anticorpo é marcador de Caspase-9-como DRONC atividade em Drosophila

Rotulagem pelo clivada-Caspase-3 de anticorpos persistir no dcp-1 drICE mutantes duplos

Para avaliar a especificidade do clivada-Caspase-3 de anticorpos, analisamos olho discos imaginais de terceiro instar de larvas. Em discos imaginais oculares de tipo selvagem, o anticorpo detecta algumas células moribundas espalhadas pelo disco (figura 1a). Surpreendentemente, em discos oculares duplamente mutantes para os alelos nulos dcp-1Prev e drICEΔ1 (ref.14, 15), O anticorpo clived-Caspase-3 ainda rotula as células (figura 1b). Rotulagem em dcp-1Prev drICEΔ1 mutantes duplos ocorre em clusters (Figura 1b), semelhante ao que foi observado anteriormente, quando a morte celular foi bloqueado pela expressão da Caspase-3 inibidor P35.3 Estas observações sugerem que as clivadas-Caspase-3 anticorpo ainda detecta um epítopo na ausência da Caspase-3-como as proteínas DCP-1 e DRICE. No entanto, como a apoptose nesta fase não ocorre em um padrão definido, estávamos incertos sobre a especificidade destes sinais de rotulagem.

Portanto, utilizou-GMR-hid transgenes, uma bem caracterizada apoptótico modelo,5 para aprofundar a especificidade da clivada-Caspase-3 de anticorpos. Através da expressão movida por GMR do gene pro-apoptótico hid especificamente na metade posterior do olho em desenvolvimento, transgêneros GMR-hid induzem apoptose em duas ondas distintas,como mostrado pelo anticorpo clived-Caspase-3 e TUNEL labeling28 (figura 1c, d). Para avaliar a especificidade do anticorpo clived-Caspase-3, examinámos os discos oculares GMR-hid que eram duplamente mutantes para dcp-1Prev e drICEΔ1. Consistente com a expectativa, a perda de dcp-1Prev e drICEΔ1 AB-rogam completamente a apoptose TUNEL-positiva em discos GMR-hid (figura 1f). Surpreendentemente, no entanto, os discos oculares DCP-1Prev drICEΔ1 mutantes duplos GMR-hid mostraram ainda uma forte imunoreactividade com anticorpos clived-Caspase-3 (Figura 1e). Assim, o anticorpo clived-Caspase-3 não detecta ou não apenas DRICE e/ou DCP-1. Notamos, no entanto, que a aparência de rotulagem do anticorpo clived-Caspase-3 muda na ausência de DCP-1 e DRICE (compare a figura 1c e e). O sinal de etiquetagem não está mais restrito a duas ondas distintas (figura 1c), mas sim preenche todo o compartimento posterior do disco ocular e está confinado a células interomatidais (figura 1e). Foi notificada uma alteração semelhante do padrão de rotulagem dos anticorpos CM1 após expressão do inibidor da caspase P35.3 Esta alteração do padrão de rotulagem é provável devido ao facto de as células em DCP-1Prev drICEΔ1 driceδ1 duplo mutante não morrerem (figura 1f) e, assim, manter o epítopo detectado pelo anticorpo clived-Caspase-3. No entanto, é importante notar que esta análise demonstra a detecção de um epítopo na ausência de Caspase-3-como as proteínas DCP-1 e DRICE por clivada-Caspase-3 de anticorpos.

Imunoreactividade do anticorpo clived-Caspase-3 depende dos componentes de apoptossoma DRONC e ARK

existem duas possibilidades de os rótulos de anticorpos clived-Caspase-3 dcp – 1 drICE mutantes duplas, embora não sejam apoptóticos. Em primeiro lugar, o anticorpo pode não detectar um epítopo apoptótico; ou em segundo lugar, o anticorpo pode detectar um epítopo apoptótico gerado a montante ou em paralelo com o DCP-1 e o DRICE. Para distinguir essas possibilidades, examinamos o mutante de discos oculares GMR-hid para os componentes apoptossomas DRONC e ARK, que atuam a montante de DRICE e DCP-1. Nos discos oculares dronc e ark mutantes GMR-hid, bloqueiam-se tanto os rótulos de anticorpos TUNEL como clived-Caspase-3 (Figura 1 g,h; figura 3a,b). Estes dados confirmam que o anticorpo clived-Caspase-3 detecta efectivamente um epítopo apoptótico em Drosophila. Além disso, como não consegue detectar o epítopo apoptótico em dronc e ark mutantes, mas não em DCP-1 drice mutantes duplos, é mais preciso considerar o anticorpo clived-Caspase-3 como um marcador para a atividade DRONC, em vez de atividade efetora da caspase, em células Drosophila moribundas.

O tripeptídeo ETD é apoptótico epítopo detectado pelo clivada-Caspase-3 de anticorpos

O epítopo detectados pelo clivada-Caspase-3 de anticorpos depende DRONC atividade. Pode ser possível que o anticorpo reconheça directamente o DRONC activado. Alternativamente, também é possível que o anticorpo clived-Caspase-3 detecte um epítopo gerado através da clivagem de um substrato desconhecido por DRONC ativo, independentemente de DRICE e DCP-1.

para distinguir estas duas possibilidades, alinhámos os resíduos da cisteína catalítica (Cys163) ao local de clivagem em Asp175 da Caspase-3 humana (peptídeo Caspase-3) com as regiões correspondentes das caspases de Drosophila (figura 2a; ver também ref. 3). Os resíduos c-terminais do peptídeo caspase-3, ETD, são conservados em DRICE e DCP-1 (Figura 2a). Semelhante ao Caspase-3, Este é o local de clivagem para ativação de pelo menos DRICE,29 e possivelmente DCP-1. É interessante notar que o N-terminal, dois terços do peptídeo Caspase-3, apresenta maior semelhança com DRONC; seis em cada nove resíduos são conservados (figura 2a). Esta parte do peptídeo Caspase-3 é menos bem conservada em DRICE, DCP-1 e nas restantes Drosophila caspases. Embora a clivagem entre as subunidades grandes e pequenas do DRONC não seja necessária para a sua actividade,30, 31 e possa não ocorrer in vivo, considerámos a possibilidade de que os anticorpos dirigidos contra a parte N-terminal do peptídeo Caspase-3 possam detectar directamente DRONC activo nas células moribundas.

usamos o bloqueio de peptídeos para avaliar qual o epitopos da Caspase-3 peptídeo são detectados pelo clivada-Caspase-3 de anticorpos morrendo Drosophila células. As sequências dos peptídeos de bloqueio são mostradas na figura 2b e sublinhadas na figura 2a. O peptídeo de bloqueio a (TETD) é derivado do DRICE e do DCP-1 e o peptídeo de bloqueio B (CRGDEYDLG) corresponde à região de maior semelhança em DRONC (figura 2a,b). O peptídeo C é um peptídeo de controlo correspondente aos resíduos imediatamente adjacentes ao peptídeo B em DRONC (figura 2a,b). O peptídeo D é outro peptídeo de controlo, que é muito semelhante ao peptídeo a e é derivado do prodomain de DRONC na posição 113. Se o prodomain de DRONC for clivado neste local, exporá o ESD no seu c-terminus, que é muito semelhante ao C-terminus do peptídeo Caspase-3 (ETD, peptídeo a) e pode, assim, ser detectado pelo anticorpo clived-Caspase-3.

os péptidos bloqueantes foram misturados com o anticorpo clived-Caspase-3 60 minutos antes da incubação com os discos imaginais oculares. Os resultados das experiências de bloqueio são resumidos na figura 2b e para os peptídeos a e B são apresentados na figura 2c–F. O peptídeo a é suficiente para bloquear toda a imunoreactividade do anticorpo clived-Caspase-3 no GMR-hid e no dcp-1 drICE dos discos oculares mutantes duplos GMR-hid (figura 2c,d). Em contrapartida,o peptídeo B não revoga a imunoreactividade do anticorpo nestes discos (figura 2e, f). Os peptídeos de controlo C E D também não bloqueiam a imunoreactividade clived-Caspase-3 (Figura 2b; dados não apresentados).

estes dados demonstram que o anticorpo clivado-Caspase-3 detecta especificamente o epítopo ETD em células apoptóticas. Entre as caspases de Drosophila, este epítopo só está presente em DRICE e DCP-1, Portanto, tornando muito provável que o anticorpo realmente detecte essas caspases efetoras. Em contraste, o facto de os peptídeos B, C E D derivados de DRONC não bloquearem a imunoreactividade sugere que é improvável que o anticorpo detecte directamente DRONC activo. Portanto, como o anticorpo clived-Caspase-3 não perde imunoreactividade em DCP-1 drice mutantes duplos (figura 1e), detecta pelo menos uma outra proteína, que expõe o epítopo ETD de uma forma dependente de DRONC.

Ativação do DCP-1, independentemente da ARCA restaura clivada-Caspase-3 imunorreatividade

A análise apresentada na Figura 2 sugere, mas não provam, que a clivada-Caspase-3 de anticorpos, de fato, detectar clivada DCP-1 e DRICE. Para testar diretamente esta possibilidade, expressamos um GMR-ΔN-dcp – 1 transgeno em fundo mutante da arca. ΔN-dcp – 1 carece do produto n-terminal do DCP-1. Pensa-se que o δn-DCP-1, empobrecido pelo prodomain, promove prontamente o autoprocessamento, e a expressão consistente sob controlo GMR induz um fenótipo de ablação ocular.Este fenótipo da ablação ocular é causado pela indução da apoptose (figura 3c,d). Como mencionado acima, a arca mutante clones em GMR-hid fundo falhar para induzir TUNEL-positivos apoptose (Figura 3b) e o clivada-Caspase-3 de anticorpos não têm qualquer imunorreatividade na arca clones (Figura 3a), sugerindo que nem DCP-1 nem DRICE, nem o desconhecido DRONC substratos são clivados na arca mutante clones. Portanto, testamos se a expressão de ΔN-Dcp – 1 na ausência de atividade apoptossómica, ou seja, em clones da arca, pode restaurar a etiquetagem de anticorpos clived-Caspase-3. Em comparação com o tecido de tipo selvagem (marcado pela GFP na figura 3c,c’), O número de células positivas clivadas-Caspase-3 é fortemente reduzido em clones mutantes da arca (figura 3c,c’) sugerindo que a activação do ΔN-DCP-1 é, pelo menos, parcialmente dependente do apoptossoma. No entanto, cerca de 50% dos clones mutantes da arca (n=32) No fundo GMR-ΔN-Dcp-1 contêm células imunoreativas clivadas-Caspase-3 (setas na figura 3c, c’). É improvável que seja um artefato de rotulagem, porque estas células também são TUNEL-positivas (figura 3d, d’). Portanto, como DRONC é inativo em fundo mutante da arca sugerindo que o sinal de rotulagem clived-Caspase-3 não é causado pelo substrato DRONC desconhecido, esta análise demonstra que o anticorpo clived-Caspase-3 realmente detecta DCP-1 clivado. Também é possível que o anticorpo clived-Caspase-3 detecte DRICE clived nesta experiência, porque o DCP-1 pode proteoliticamente processar o DRICE, pelo menos in vitro.29, 32 uma análise semelhante com DRICE não pôde ser realizada porque o GMR-drICE e o GMR-ΔN-drICE não causam um fenótipo de ablação ocular.32 No entanto, quer o DCP – 1 Clive ou não o DRICE in vivo, dada a semelhança de sequência do DCP-1 e do DRICE no C-terminus da subunidade grande e os dados de bloqueio do peptídeo da Figura 2, sugere que o anticorpo também pode detectar o DRICE clivado.