O Chp1 chromodomain vincula o H3K9me cauda e o nucleosome núcleo para montar heterochromatin

Plasmídeos e cepas de construção

Chp1CD mutantes para expressão e purificação foram gerados através inverso de PCR utilizando os primers listados no Quadro Suplementar S2 partir da pET28a Chp1 chromodomain plasmídeo . Os ensaios de resgate de heterocromatina foram realizados através da introdução de plasmídeos contendo proteína mutante chp1 wt e chp1 sob o seu promotor endógeno numa estirpe chp1Δ (SP170, ver Quadro suplementar S3) . o gene chp1 de comprimento completo e o seu promotor endógeno (-949 bp desde o início da sequência de codificação chp1+) foram clonados no plasmídeo pREP1. os mutantes de cromodomina chp1 foram gerados por PCR inversa utilizando os iniciadores listados no quadro suplementar S2 e transformados na estirpe chp1Δ indicada.

De genômica de integração, o pREP1 plasmídeo foi modificado para substituir o nmt1+ promotor com a seguinte integração de cassete: (SphI) Região 5′ do Chp1 (gene do Cromossomo I, 2215500-2215055) (AscI)—HphMX6 resistência de cassetes(SphI) Chp1 endógena promotor (Cromossomo eu, 2214829-2214664)—Chp1 sequência codificante—(BamHI) Chp1 terminator (Cromossomo eu, 2210976-2210582) (BamHI). A cassete de integração (tanto a cassete chp1+ como a cassete chp1LOOP1B/2B) foi então amplificada e transformada pela electroporação em estirpes SP101, SP170 e SP64. As células foram então seleccionadas em placas sim+ Higromicina (50 mg ml−1 Higromicina). Colónias únicas foram isoladas, rastreadas e sequenciadas para a inserção genómica da cassete de resistência HphMX6 e das mutações LOOP1B/2B.

as estirpes contendo plasmídeos foram cultivadas em meio médio mínimo de Edimburgo (EMMC) – leu media. Todas as estirpes e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados nos quadros suplementares S3 e S4.Purificação proteica his6-SUMO-Chp1CD e todos os mutantes CD foram expressos em E. coli BL21 (de3) (pLys) e purificada por cromatografia de afinidade utilizando resina Ni-neta (GE Healthcare, Freiburg, Alemanha). His6-SUMO-Chp1CD contém clivagem de trombina entre duas etiquetas .

no total, foi adicionada iptg de 0,2 mM para induzir a expressão proteica seguida de crescimento a 18 °C O/N. as células foram colhidas por centrifugação e re-suspensas em tampão de lise [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico(HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 20 mM imidazol]. Após congelação por flash, as células foram descongeladas e incubadas durante 30 minutos na lisozima antes da sonificação (Branson Sonifier 250-output 4, ciclo de funcionamento 40). Centrifugou-se a suspensão (12000 g, 20 min a 4 °C) e adicionou-se o sobrenadante à resina Ni-neta pré-equilibrada em tampão de ligação (20 mM de HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) e incubou-se durante 30 minutos a 4 °C em rotação. A resina foi então lavada em 5× com tampão de ligação e as proteínas foram eluídas em tampão de eluição (20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Os mutantes e wt Chp1CD foram então tingidos de O / N num tampão contendo 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD foi então purificado através de filtração em gel (Superdex 75 pg; GE Healthcare) e dialisado em um tampão contendo 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.As células para os ensaios silenciosos foram aumentadas para 0, 7–1 e depois normalizadas para uma concentração final de 1×107 células ml−1 da cultura. Diluições em série decuplicadas foram feitas para que o ponto de maior densidade contivesse 1×105 células. As células foram detectadas em placas não selectivas (sim) e ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA 1 g l−1 5-FOA). As placas foram incubadas a 32 ° C durante 2-3 dias e fotografadas. As células têm um gene repórter ura4 inserido em repetições IMR pericentroméricas (locus heterocromático). Quando o gene repórter do ura4 é silenciado, as células podem crescer em meio contendo 5-FOA. Quando a heterocromatina é perdida, gene repórter do ura4 é expresso e as células são incapazes de crescer em meio 5-FOA.

a detecção de níveis de ARN pelo qPCR(RT-qPCR)

culturas de levedura (10 ml) foram cultivadas para uma OD600 de 0, 7–1, 5. As células foram então re-suspensas em 500 µl de tampão de lise (pH 5, 2 NaOAc 300 mM, 1% de sulfato de dodecilo sódico) e 500 µl de fenol–clorofórmio e incubadas a 65 °C durante 10 minutos com mistura constante. A fracção aquosa foi separada do fenol-clorofórmio por centrifugação (10 min, 20 000 g) e do etanol precipitado. Os ácidos nucleicos foram tratados com DNAse i (Roche, Basileia, Suíça) durante 30 minutos a 37 °C, seguido de 15 minutos a 75 °C de inactivação térmica. O DNA complementar foi sintetizado usando 100 ng de RNA e 1 pmol de oligos de DNA com Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) Usando condições padrão. Os níveis de ARN foram quantificados com qPCR utilizando o Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR kit e normalizados ao gene eucromático tdh1.Os ensaios de mudança de transferência de mobilidade electroforética para ARN

o ensaio de mudança de ARN foi efectuado após as condições previamente notificadas . No total, 0.66 pmols de 32P Rna centromérico de 30 nt marcado radioactivamente foram incubados com cromodomain Chp1 de 10 µM (tipo selvagem e mutante) num tampão contendo 20 mM de pH Tris-HCl de 7, 5, 100 mM KCl, 0, 5 mM DTT e 3% de glicerol. Para o RNA EMSA com 100 nt dg centromeric transcrições, 2 pmols de 32P radiolabeled RNA foram incubadas com 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmols de Chp1CD proteína (wt e LOOP1B/2B mutante) em 15 µl de volume final. O peptídeo H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Alemanha) foi adicionado em um peptídeo 1:1 Chp1CD – H3K9me, como relatado em . A incubação foi efectuada durante 1 h em gelo e as amostras (volume final de 20 µl) foram então carregadas num gel nativo de acrilamida-TBE a 10% (razão Bis-acrilamida 1:29). Para o RNA in vitro de pull-downs, 1 µg de SUMÔ-Chp1CD (tipo selvagem e LOOP1B/2B mutante) foi obrigado a 15 µl de Ni-NTA resina (GE Healthcare) e o H3K9me3Nucleosome foi adicionado para montar o Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complexas em Ligação buffer (20 mM de HEPES pH 7.5, 75 mM de KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM de imidazol). Depois de lavar três vezes com 50 µl de ligação buffer, 2 pmols de 32P-rotulado 100nt dg RNA foram adicionados e incubadas com o Chp1CD-Nucleosome resina em gelo por 1 h. A resina foi centrifugado a velocidade lenta (60 g, 10 s) e o fluxo através coletados. A resina foi lavada por três vezes com pelo menos 3 × (v/v) tampão de ligação e o complexo de ARN-nucleossomo-Chp1CD foi eluído por adição de tampão imidazol de 300 mM (20 mM HEPES pH 7, 5 mM KCl, 0, 5 mM DTT, 300 mM imidazol), incubado durante 1 h em gelo com mistura com 5 minutos de intervalo (fracção ligada). As amostras foram carregadas com um gel de acrilamida nativo do TBE a 10% (relação Bis-acrilamida 1: 29) e rodadas durante 2 h a 10 mA a 4 °C. Após a exposição nocturna, as géis foram digitalizadas utilizando o fosfoimager TyphoonFLA9000.

cromatina imunoprecipitação

culturas de levedura (100 ml) foram cultivadas para uma OD600 de 0, 7 e reticulados com 3% de formaldeído à temperatura ambiente durante 15 minutos, como descrito . A reacção foi extinta com 125 mM de glicina durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram re-suspensas em 500 µl de tampão de lise (50 mM de HEPES pH 7, 5, 1.5 M acetato de sódio, 5 mM MgCl2, 2 mM ácido etilenodiaminotetracético, ácido tetraacético de etilenoglicol 2 mM, 0, 1% NP-40, 20% glicerol) contendo inibidores da protease (comprimidos de cocktail de inibidores da protease, Roche, completo, ácido etilenodiaminotetracético livre). As células congeladas foram lysed usando o Bead beater MP Biospec. Após a lise, o extracto foi sonificado 35× para 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Bélgica) e rodado a 13 000 g durante 15 minutos para obter o sobrenadante de cromatina. Para o ADN de entrada, foram utilizados 50 µl do sobrenadante. Para imunoprecipitações, os sobrenadantes foram normalizados com base na concentração de proteínas e incubados com anticorpos anti-dimetilados H3K9 ou anticorpo anti-Chp1 (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 e Chp1, Abcam no. Ab18191), imobilizados em Dinas magnéticas, durante 2 h a 4 ° C. as esferas e as proteínas imobilizadas foram lavadas 5× com 1 ml de tampão de lise. As proteínas foram eluídas por incubação com 150 µl de tampão de eluição (pH 8.0 de Tris-HCl de 50 mM, ácido etilenodiaminotetraacético de 10 mM, 1% de sulfato de dodecilo de sódio) a 65 °C durante 15 minutos. As ligações cruzadas foram invertidas por incubação a 65 °C durante a noite, seguida de degradação do ARN com RNase A e degradação das proteínas com Proteinase K. o ADN foi então recuperado por extracção de fenol–clorofórmio e precipitação de etanol e quantificado utilizando qPCR. O gene euchromático tdh1 foi usado para a normalização. Os oligonucleótidos utilizados nos ensaios de imunoprecipitação com cromatina estão listados na tabela suplementar S2.

nucleossomas reconstituição in vitro e metilação (H3K9me3)

Nucleosomas foram reconstituídos utilizando histonas de Xenopus laevis e a sequência 601, tal como descrito anteriormente . A metilação in vitro foi feita como descrito . O pico de +42 Da foi observado na publicação original e não é uma contaminação (Matt Simon, comunicação pessoal e descrito em ).

In vitro Chp1CD-H3K9me3 MLA formação e eluição de complexos nucleossomas

no total, 5 µg de Chp1CD estavam ligados a 15 µl de resina Ni-neta em tampão de ligação (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) durante 20 minutos a 4 °C. A resina foi lavada uma vez com cinco volumes de tampão de ligação e 10 µg de nucleossomas analógicos de metil lisina (MLA) de h3k9me3 foram adicionados (os nucleossomas de MLA foram previamente dialisados em tampão de ligação) num volume final de 20 µl e incubados 1 h em gelo com uma re-suspensão constante a cada 5 minutos. Após a incubação, a resina foi centrifugada (60 g para 10 s) e o fluxo recolhido. A resina foi então lavada três vezes com cinco volumes de tampão de ligação. O complexo SUMO-Chp1CD-H3k9me3nucleossoma foi eluído adicionando trombina (Sigma, Munique, Alemanha) por 2 h em gelo em 20 µl de tampão de ligação. A formação complexa foi então avaliada através da electroforese em gel SDS-poliacrilamida em 15% de géis de acrilamida e através de uma coloração EM negativa.

Chp1CD H3K9me3 peptídeo de ligação

no total, 1 µg de peptídeo H3 (1-21)-GGK(biotina) (Eurogentec) foi incubado com 15 µl de resina de agarose da estreptavidina (Invitrogénio) em HEPES de 20 mM pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Em seguida, adicionaram-se aproximadamente 5 µg de Chp1CD (tanto wt como mutantes) num volume final de 20 µl e incubaram-se durante 1 h no gelo nas mesmas condições de tampão. A resina foi lavada três vezes e a eficácia de ligação foi avaliada em electroforese em gel SDS-poliacrilamida em 15% de géis de acrilamida. A quantificação da ligação foi feita usando o software ImageJ. A ligação de cada mutante foi normalizada para wt Chp1CD para cada ensaio.

Microscale thermophoresis (MST)

para o MST SUMO tag foi removido de construções Chp1CD com protease Ulp1. No total, 100 µg de Chp1CD de tipo selvagem e mutante foram rotulados fluorescentemente usando o Kit de rotulagem de proteína monolítica MO-L003 monolítico BLUE-NHS (Amine Reactive) de acordo com as instruções do fabricante (Nanotemper Technologies, Munique, Alemanha). Estimou−se uma razão de fluorescência: proteína 1: 1 Utilizando a funcionalidade “proteínas e Etiquetas” do software Nanodrop1000 e cada Cromodomain Chp1 foi executado com um gel de acrilamida de 15% SDS para normalizar as concentrações para 0, 1 mg ml-1.

reacções foram reunidas em 20 µl com 300 ng de Chp1CD fluorescente, e quantidades crescentes de peptídeo-histona H3 (1-21)-GGK(Biotin) (Eurogentec) ou H3k9me3nucleossomas, num tampão contendo 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT e 0,05% Tween-20. Para os ensaios de ligação de H3k9me3nucleossomas, o glicerol foi adicionado à concentração final de 10%. Para os ensaios de H3K9me3 estas diluições foram utilizadas para medições: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Para o ensaio H3k9me3nucleossoma, utilizámos as seguintes diluições para as medições: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

MST runs were performed using standard treated capillaries (Nanotemper Cat#K002) on the NT.115 Monolith instrument. Todas as medições foram realizadas usando 80% de LED e 40% de potência MST, com Laser de 30 s no tempo e Laser de 5 s fora do tempo. Para cada experiência, foram realizadas cinco medições individuais.

os dados foram analisados com a GraphPad Prism software version 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) e o SigmaPlot software version 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, EUA). Para os ensaios de ligação peptídica, com as curvas mostrando uma tendência sigmóide distinta, ajustamos a equação sigmoidal assimétrica logística de cinco parâmetros Richards e calculamos automaticamente o Kd. Para os ensaios de ligação de h3k9me3nucleossomas, como a tendência de dados brutos não era mais sigmóide para todas as proteínas analisadas, uma equação polinomial de terceira ordem (cúbica) foi usada para ajustar e comparar os pontos de dados brutos de tipo selvagem Chp1CD e os diferentes mutantes. O Kd foi calculado com base na característica “interpolação” do Software prism GraphPad, utilizando o valor de 50% ligado/não ligado no eixo Y.

tripsina Nucleossómica digestão

os nucleosomas de Tailless foram preparados incubando nucleosomas reconstituídos com uma resina de Tpck-tripsina imobilizada (Termocientífica) durante 2 h à temperatura ambiente num tampão contendo 20 mM de HEPES pH 7, 5, 75 mM KCl e 0, 5 mM DTT . A digestão triptica gera Bandas de histona muito definidas e tem sido caracterizada em detalhes onde exatamente cortes de tripsina .

ensaios de ligação de nucleossomas com mutantes Chp1CD

Chp1CD de tipo selvagem e ensaios de ligação de nucleossomas Mutantes foram realizados como descrito anteriormente para a formação do complexo Nucleosomo Chp1CD-H3KC9me3 MLA em 20 mM de HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Resinas e insumos foram realizados em SPS-poliacrilamida gel electroforese a 15% de géis de acrilamida. Todas as amostras foram então analisadas por imunoblot com histona anti-H3 (AbCam, Cambridge, Reino Unido, 1: 1000), ou anticorpo anti-H3K9me3( AbCam, 1: 1000), IgG-HRP anti-cabra (BioRad, 1:3000), IgG-HRP anti-coelho (BioRad, Munique, Alemanha, 1:3000).

Negativo mancha de microscopia eletrônica

Depois de trombina de eluição, 3 µl do Chp1CD–H3KC9me3 nucleosomes complexo foram vistos em um brilho descarregada grade de cobre (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Alemanha) revestido com 1 nm de filme de carbono por 45 s. Depois de uma lavagem rápida com água, a grade foi incubado por 15 s em 2% de Acetato de Uranilo. Imagens negativas de manchas foram coletadas em um microscópio eletrônico de transmissão FEI Morgagni.

Cryo-em a Chp1CD–H3KC9me3 nucleosomes complexo

Cryo-EM grades (Holey carbono revestido de grades, Cu 300 Malha R3/3+1 nm camada de carvão, Quantifoil) foram preparadas utilizando um Vitrobot Mark IV (FEI Company). O Cryo-EM dados foram coletados por meio de um Titã-Krios microscópio eletrônico de transmissão (FEI Empresa, Hillsboro, or, EUA) a 200 KeV e uma ampliação de 113 000× no plano do CCD usando um F816 câmera CMOS (TVIPS GmbH, Gauting, Alemanha), resultando em uma imagem com tamanho de pixel de 1,2 Å por pixel sobre o objeto de escala (tamanho do pixel do CCD foi de 13,6 µm). Para a recolha automatizada de dados, foi utilizado o software EM-TOOLS e os dados foram recolhidos num intervalo defocus de 10 000-40 000 Å.

No total, 2 480-micrografias para a Chp1CD–H3KC9me3 complexo e 991-micrografias para a H3KC9me3 nucleosome de controle, respectivamente, foram selecionados para uma única partícula de análise, usando o Xmipp pacote de software (Complementar Figura S9A) . Poucos milhares de partículas foram colhidas manualmente e cuidadosamente limpas do ruído. Essas partículas foram então usadas para a coleta de partículas semi-automática e automática em XMIPP. A função de transferência de contraste foi determinada pelo CTFFIND3 . Partículas únicas selecionadas foram convertidas em formatos de aranha e de milhões para análise adicional (figura suplementar S9B). As médias de classe bidimensionais foram geradas com o pacote de software RELION (figura suplementar S9C) . As médias de classe más foram removidas de outras análises de dados. Os refinamentos tridimensionais foram posteriormente feitos com os pacotes de software SPIDER e RELION .

a classificação de partículas não supervisionadas foi realizada por semeadura aleatória com os mapas de densidade completos sem classificação focada no pacote de software SPIDER. As tentativas de usar a classificação focalizada resultaram em um forte viés e ruído sobrefitting em regiões de interesse. Portanto, nós não usamos a classificação focada para reduzir o viés. Na classificação inicial feita em Aranha, as classes C0-C6 e N0–N5 foram projetadas para trás usando ângulos de mapas C0 e N0 e estas classes não foram totalmente refinadas. Aqui nós apenas queríamos selecionar classes que tivessem densidade adicional ligada ao nucleossomo. Partículas gerando mapas com diferentes densidades de Chp1CD foram separadas e classificadas. Aproximadamente 20 Rodadas de classificações aleatórias de semeadura foram realizadas até que tenhamos particionado partículas em cinco grupos diferentes (figura suplementar S3). As Classes C11-C15 foram refinadas com pacote de software RELION. Os refinamentos finais dos complexos de Nucleossomos Chp1CD-H3k9me3 (classe C15) e Nucleossomos control Foram feitos com o pacote de software RELION. Para a referência final de refinamento foi filtrada para ~50 Å (filtro RELION). A referência que usamos não tinha nenhuma das características observadas em reconstruções refinadas (a dupla hélice de DNA não é resolvida, o sulco maior não é visível, as hélices α não são resolvidas). Isso indica nenhum viés de referência em nossa estrutura. A resolução do controle nucleossomo atingiu 7.3 Å usando auto-refina em simetria de RELION e C2 (FSC 0.143 corte de dois mapas refinados de forma independente). Chp1cd-H3k9me3nucleossoma complex was refined to 10 Å (FSC 0.143 cutoff of two independently refined maps) with no symmetry applied.

a resolução Local foi calculada usando software ResMap (volume único final, minRes=7, maxRes=14, automask). A resolução média determinada pelo mapa é de 9,4 Å para o Complexo Nuclear Chp1CD-H3k9me3, confirmando independentemente a resolução média previamente determinada de 10 Å (FSC 0.143) (figura 1c). Para o complexo de nucleossomas Chp1CD-H3k9me3, a resolução local para o nucleossoma é de 9-10 Å e para o ligando ~10 Å (figura 2a). A distribuição do ângulo de Euler para reconstruções finais é mostrada tanto para nucleossomo quanto para o complexo Chp1CD-H3k9me3nucleossomo (figura suplementar S9D). Todas as orientações estão presentes com uma preferência por vistas superiores e laterais.

modelos moleculares foram construídos usando o pacote de software Chimera usando estrutura cristalina rígida do corpo . O ajuste na densidade foi feito com as opções de Quimera ‘Fit in Map’ e ‘Fit in Segments’ com apenas pequenos ajustes manuais. A segmentação e visualização de todos os mapas crio-EM também foi feita com o software Chimera .