medição Comparativa da CNP e NT-proCNP humanos amostras de sangue: uma metodologia de avaliação

Introdução

C-tipo de peptídeo natriurético (CNP), identificou, em 1990, por Sudoh et al., é o membro mais antigo da família do peptídeo natriurético . O CNP estimula selectivamente o receptor 2 do peptídeo natriurético humano (NPR2), que activa a cinase dependente do GMPc (cGK) elevando a concentração intracelular do GMPc . Além disso, o CNP liga-se ao NPR3 e, por sua vez, desactiva a proteína cinase a pela inibição Gi-proteica dependente do adenilato ciclase . O CNP tem propriedades anti-proliferativas e anti-migratórias e também foi identificado como um fator relaxante derivado do endotélio . Além disso, o CNP inibe a restenose neointimal, reduz a remodelação vascular constrictiva e a lesão da reperfusão por isquemia cardíaca . A CNP desempenha um papel importante no crescimento ósseo, na reprodução, no crescimento do nervo, na re-endotelialização, bem como na função renal, pancreática e cardíaca . Além disso, o CNP foi recentemente reconhecido como estando envolvido no desenvolvimento da formação aterosclerótica de placas .

devido à pletora das funções CNP, este peptídeo tem atingido um interesse crescente na pesquisa cardiovascular durante os últimos anos. No entanto, os estudos relativos às concentrações de CNP em amostras de sangue são inconsistentes. Alguns destes estudos mediram concentrações de CNP ou do seu pró-péptido amino-terminal (NT-proCNP) em amostras de soro e outros utilizaram amostras de plasma . Infelizmente, ainda não foram comunicados pormenores sobre potenciais atrasos durante a colheita de sangue e subsequente processamento da amostra. Na literatura disponível até agora, não existem dados sobre a diferença das concentrações de CNP/NT-proCNP entre amostras de soro e plasma. Além disso, a influência do atraso no processamento da amostra de sangue permanece incerta. Além disso, a concentração de CNP nas amostras de soro e plasma variou acentuadamente (Quadro 1). Portanto, o objetivo deste estudo era responder às seguintes questões metodológicas: (1) o processamento retardado das amostras de sangue armazenadas à temperatura ambiente causa viés? (2) Existe alguma diferença entre as concentrações séricas e plasmáticas de CNP ou NT-proCNP? (3) estas diferenças dependem do tempo?

Métodos de

estudamos 12 voluntários do sexo masculino (idade média de 29 ± 2 anos, com peso normal, sem terapia de droga, sem história de doença cardiovascular ou outras doenças, 3 fumantes). Foi obtido o consentimento informado de todos os indivíduos investigados. Trigêmeos de amostras de sangue em jejum foram retirados de todos os voluntários às 8 horas da manhã. As amostras de sangue foram colhidas utilizando o sistema de recolha s-Monovette® de 7, 5 ml (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha) contendo ou um activador da coagulação (Caulino) para amostras de soro, citrato de sódio para amostras de plasma ou EDTA de potássio para amostras de sangue total. Todas as amostras para análise de base foram imediatamente centrifugadas a 2000 × g durante 10 minutos a 4 ° C e o sobrenadante foi armazenado a -70°C até à análise. Para análises intercalares (30 minutos ou 2 horas), As amostras de plasma foram centrifugadas a 2000 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e armazenado à temperatura ambiente durante 30 ou 2 horas. Após a coagulação do sangue, as amostras de soro foram processadas de forma idêntica a amostras de plasma. O sobrenadante foi conservado à temperatura ambiente durante 30 ou 2 horas. As amostras de sangue foram armazenadas à temperatura ambiente sem centrifugação. Após 30 minutos ou 2 horas, As amostras de sangue completo foram centrifugadas a 2000 × g durante 10 minutos a 4°C. o sobrenadante foi removido e armazenado a -70°C até à análise. A concentração do CNP foi medida utilizando o Kit CNP-22 EIA (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração NT-proCNP foi medida utilizando o Kit NT-proCNP EIA (Biomedica, Viena, Áustria) de acordo com o protocolo do fabricante. A ANOVA de Sentido Único foi utilizada para comparação entre grupos. Para comparações emparelhadas, foi aplicado o teste-T. Os dados são apresentados como médias ± desvio-padrão (DP) ou intervalo de confiança de 95% (95% – IC). A significância estatística foi assumida em p < 0, 05. Os dados foram analisados usando MedCalc® para Windows, versão 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica).

Resultados

, Como mostrado na Figura 1a, linha de base concentrações do CNP em soro, plasma, e completo as amostras de sangue foram 0.997 ± 0.379 ng/ml, 1.933 ± 0.699 ng/ml, e 0.991 ± 0.489 ng/ml, respectivamente. As concentrações plasmáticas de CNP foram significativamente mais elevadas quando comparadas com as amostras de sangue total e sérico em todos os pontos temporais (ANOVA, p = 0, 001 no início, p < 0, 001 a 30′ min. e p = 0, 003 a 120 ‘ min.). Não se observou qualquer diferença significativa entre as amostras de soro e de sangue total em qualquer momento (ANOVA, p > 0, 05). Linha de base concentrações de NT-proCNP em soro, plasma, e completo as amostras de sangue foram de 58,5 ± 28.3 pg/ml, de 60,3 ± 23.9 pg/ml, e 50,7 ± 21.4 pg/ml, respectivamente (Figura 1b). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos em qualquer momento (ANOVA, p > 0, 05). Em amostras de sangue total, a concentração de lactato aumentou significativamente após 2 horas em comparação com o valor basal (3, 2 ± 0, 8 mM vs. 2, 0 ± 0, 6 mM, p < 0, 001). Além disso, o valor do pH diminuiu de 7,34 ± 0.0, 03 após 2 horas (p < 0, 001).

discussão

nosso estudo revelou que CNP E NT-proCNP são estáveis no soro e em amostras de sangue total por pelo menos duas horas à temperatura ambiente. Consequentemente, é muito provável que a estabilidade do peptídeo CNP não seja afectada por qualquer atraso no processamento da amostra durante pelo menos duas horas. O ProCNP já foi comunicado (protocolo do fabricante, condições de armazenamento desconhecidas das amostras de sangue) como estável durante pelo menos 2, 5 horas. Assim, as nossas experiências confirmaram a estabilidade do NT-proCNP mesmo à temperatura ambiente. A concentração de NT-proCNP em todos os tipos de amostras permaneceu constante durante o período de tempo até 2 horas, indicando estabilidade duradoura desta proteína. Conforme indicado no quadro 1,a concentração média de NT-proCNP (56, 5 ± 24.3 pg / ml) medido neste estudo estava dentro do intervalo notificado (Ver Tabela 1) de indivíduos saudáveis (3, 7-432 pg/ml).

em contraste com NT-proCNP, a concentração de CNP foi significativamente mais elevada em amostras de plasma em comparação com amostras de soro e sangue total (Figura 1). Até à data, nem o nosso serviço técnico do grupo nem o dos fabricantes encontraram quaisquer provas relativas à influência do tipo de amostra no ensaio ELISA utilizado neste estudo. Contudo, no início, sobrenadante de amostras de plasma e sangue total era idêntico, à excepção do tipo de inibidor da coagulação sanguínea utilizado. Este inibidor foi o citrato de sódio no grupo plasmático e o EDTA no grupo da amostra de sangue total. As amostras de sangue total revelaram resultados comparáveis às amostras de soro (p = 0, 98). Por conseguinte, é muito provável que o citrato de sódio possa influenciar significativamente a concentração medida de CNP no plasma e, consequentemente, falsificar os resultados obtidos com esta técnica.

inesperadamente, as concentrações basais de CNP tanto em amostras de plasma como de soro foram cerca de mil vezes mais elevadas do que Noutras notificações (Tabela 1) . Em todos estes estudos, o Radioimunoassay (RIA-Kit) foi utilizado para a determinação das concentrações de CNP. Em contraste, em dois outros estudos, as concentrações de CNP medidas em amostras de soro e plasma foram comparáveis aos nossos resultados no que diz respeito à magnitude da dimensão . Curiosamente, nos últimos estudos, o mesmo ELISA-Kit foi usado como em nossa investigação. Mesmo após uma avaliação exaustiva de vários factores internos e externos, não foi possível encontrar uma explicação satisfatória para esta discrepância. As medições de controlo utilizando o CNP exógeno no soro humano revelaram um erro de medição não significativo de +7,8% (95%-KI: –). O peptídeo CNP utilizado para a curva de referência foi sintetizado pelo próprio fabricante (Phoenix). Em contraste, o peptídeo CNP usado como o controle “exógeno” foi fornecido por Bachem. Como assegurado por ambos os fabricantes, sequências de aminoácidos eram idênticas e ligações de dissulfeto foram formadas em ambos os peptídeos.

no entanto, os resultados das medições de controlo interno podem ser resumidos da seguinte forma:: Em primeiro lugar, as medições de controle realizadas em nosso estudo revelaram que os kits ELISA foram utilizados corretamente, de acordo com as instruções do fabricante. Em segundo lugar, medições com amostras de controlo confirmaram a adequação da curva-padrão aplicada. Em terceiro lugar, as amostras de soro de controlo que contêm CNP exógeno revelaram uma precisão aceitável e os resultados situaram-se dentro da ordem de grandeza esperada. Em quarto lugar, uma maior concentração de CNP em amostras de plasma é provavelmente um artefacto causado pelo citrato de sódio.

tal como relatado pela Clerico e colegas de trabalho, são também conhecidas diferenças comparavelmente grandes nos resultados entre os diferentes métodos RIA e AIA, por exemplo, ANP e BNP . Clerico e colegas de trabalho concluíram que as grandes diferenças nestes resultados são mais prováveis devido à especificidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais utilizados, ao desenho do sistema de imunoensaio (teste competitivo vs. não competitivo), à matriz analítica (soro vs. EDTA vs. plasma heparinizado) utilizada e à pletora de formas circulantes de peptídeos natriuréticos, Como anteriormente relatado para imunoensaios de ANP e BNP . Estas fontes metodológicas de viés também podem ser concebíveis para os ensaios CNP E NT-proCNP e, assim, explicar a grande diferença nos resultados nos estudos citados (Tabela 1).

Limitações do estudo

reconhecemos que um tamanho de amostra de 12 é muito pequeno para concluir que não há nenhuma diferença. No entanto, do ponto de vista estatístico, seria importante especificar quão grande deve ser a diferença para ter relevância médica. Tanto quanto sabemos, esta última ainda não está claramente definida. Portanto, os meios e intervalos de confiança de 95% de todas as medidas foram dados na figura para que cada leitor possa extrair sua própria interpretação dos dados também.

em referência às concentrações séricas e plasmáticas, deve mencionar-se que os valores notificados no quadro 1 foram medidos com diferentes métodos (RIA, ELISA) em doentes com doenças diferentes. Teria sido muito útil comparar a CNP-RIA com os testes CNP-ELISA diretamente usando os mesmos espécimes, porque uma diferença de mil vezes na ordem de magnitude permanece visível. Infelizmente, as medições da RIA não estavam disponíveis no nosso laboratório. Para o NT-proCNP concentração, a última comparação foi investigada por Olney e co-trabalhadores, mostrando que o comercial de ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Viena, Áustria) apresentaram valores que foram uma média de 21% (intervalo de 11-52%) da RIA de valores. A validação cruzada do padrão de referência do kit ELISA através do ensaio RIA revelou um desacordo de 15% .

resumo

as medições do CNP e do NT-proCNP não foram provavelmente afectadas pelo atraso da procissão da amostra ou do tipo de amostra de sangue (excepto para o CNP em amostras de plasma). Para as amostras de plasma, apenas amostras de sangue anticoagulado EDTA foram adequadas para o ensaio Elisa CNP utilizado neste estudo. Consequentemente, a concentração de CNP e NT-proCNP pode ser utilizada em aplicações clínicas para determinar os efeitos do CNP. Deve também considerar-se que a concentração de NT-proCNP, sendo apenas um subproduto do peptídeo activo, pode ocultar a verdadeira natureza do CNP. No entanto, a discrepância nas concentrações medidas do CNP determinadas quer por testes RIA quer por testes ELISA continua a não ser explicada, mas parece muito provável que se deva a questões metodológicas. Portanto , como recomendado para ANP e BNP, os imunoensaios para CNP também precisam ser padronizados ou harmonizados no futuro.