letras oncológicas

introdução

o cancro do pulmão é o cancro mais comum após o cancro da mama e do cólon, em todo o Mundo (1). A ocorrência de cancro do pulmão é semelhante às taxas de mortalidadepara esta doença, devido à elevada fatalidade do cancro do pulmão. De acordo com os dados disponíveis da Agência Internacional de oncologia da investigação, prevê-se que as mortes anuais por cancro do pulmão aumentem para cerca de 10 milhões até 2030 (2).O tipo mais comum de câncer de pulmão histologicamente isadenocarcinoma, que é responsável por quase 50% de todos os cancros pulmonares(3).Histologicamente, existem dois tipos principais de cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) e não CPPC (CPPC). A SCLC representa cerca de 20% de todos os casos de cancro do pulmão, enquanto a SCLC representa quase 80% dos casos de cancro do pulmão (4). Existem três subtipos histológicos do carcinoma do pulmão de células escamosas: I) carcinoma de células escamosas (SCC), ii) adenocarcinoma, andiii) carcinoma de pulmão de células grandes, cada um representando 25, 40 e 15% do total de casos NSCLC, respectivamente (5).Apesar do reconhecimento do cancro do pulmão como um dos tipos mais agressivos de cancro, o progresso nos resultados clínicos é lento, embora exista um grande número de novos medicamentos. As questões mais importantes para esta desvantagem na manipulação clínica do câncer de pulmão é a indisponibilidade de marcadores tumorais validatserum, que são úteis tanto no diagnóstico e gravidez da doença (6). Os manitipos de doenças malignas causam efusões pleurais, e os cancros que metastizam frequentemente para a pleura são carcinomas do pulmão e da mama e linfomas. Embora o exame citológico da pleuralefusão seja considerado uma abordagem padrão para o diagnóstico, a sua sensibilidade é tipicamente de apenas 50-70% (7,8).

Um número de marcadores tumorais, includingcarcinoembryonic antigen (CEA), hidratos de carbono antigen 125 (CA125),e CYFRA21-1, um fragmento de cytokeratin 19 (CK19), tem beenevaluated como a melhor e mais precisa de marcadores tumorais no soro, bem como do líquido pleural em muitos estudos (7,8). Também foi observado que uma combinação de dois ou mais marcadores é mais poderosa do que um único marcador. No entanto, o poder de previsibilidade real destes marcadores não foi avaliado em muitos destes estudos, uma vez que a presença citológica de células tumorais foi detectada nas efusões pleurais dos pacientes (9-11). Verificou-se que muitos dos marcadores acima referidos estavam elevados nas efusões pleuraisde doentes oncológicos, em comparação com as efusões pleuraisbinais benignas (7). Verificou-se que as células humanas do cancro do pulmão derivadas da pleuralfusão são mais invasivas e metastáticas do que as células cancerígenas das lesões primárias e esta diferença pode estar relacionada com a transição epitelial-mesenquimal(EMT).

EMT, que normalmente desempenha um papel importante na morfogénese do tecido lembryónico e na fibrose pós-lesão (12, 13), é inadequadamente reactivado durante a idade adulta, sob certas condições patológicas, tais como cancro, e contribui para metástases tumorais (13). EMT é conhecido por mediar as manialterações e a resultante modulação fenótipo na tumorarquitetura. A EMT é caracterizada pela ruptura da aderência intercelular, motilidade celular elevada, perda de conceptibilidade a anoiquis e apoptose e na libertação de células do tecido epitelial (9-11). As células tumorais libertadas, que são resistentes a anoikis, assumem fenótipo mesenquimal que emite para migração, invasão e disseminação, todos contribuindo para a progressão metastática. Em muitos casos, o grau de EMT das células cancerígenas determina a gravidade do cancro (14). EMT também tem sido demonstrado estar envolvido em resistência a anoikis, que é fundamental na desinibição de metástases cancerosas em vários tumores sólidos (15).

Citoqueratinas (CKs) são marcadores tumorais comuns e são os principais elementos estruturais do citosqueleto em células epiteliais, e com base nas propriedades estruturais CKs, existem 20 subtipos. Destes, CK19 é um CK solúvel e ácido Tipo I e é expressado no revestimento epitélio da árvore brônquica e é conhecido por ser sobreexpressed em tecidos de câncer de pulmão (16). Existe degradação elevada do CK19 nas células epiteliais transformadas por via neoplásica devido ao aumento da actividade da ckaspase-3, e os fragmentos proteolíticos, particularmente,CYFRA21-1, são libertados no sangue. No entanto, alguns estudos relataram que a expressão deck19 é negativa em certos cancros pulmonares (9-11). A expressão ck19 em algumas linhas celulares de cancro do pulmão foi reduzida na sequência do factor de crescimento induzido pela TT (TGF)-β (17). Os níveis circulantes de fragmentos de CK19, incluindo o CYFRA21 – 1, provavelmente reflectem a extensão da citoesqueletalformação nas células cancerígenas e podem também associar-se ao grau de diferenciação tumoral em relação ao epitélio escamoso (16).

no presente estudo, foram empregadas amostras de tumores de 111 doentes com cancro do pulmão, e investigou-se a incidência de ck19-pressores negativosem diferentes tipos de cancro do pulmão, bem como se a indução de EMT nas células de foco primário influencia a expressão de CK19. Também examinámos se os cancros pulmonares negativos eram mais invasivos e metastáticos.

doentes e métodos

geral

todos os 111 doentes foram seleccionados de acordo com o estadiamento 7TVERSION TNM, descrito pelo American Joint Committee onCancer and Union for International Cancer Control in 2007 (9-11). No presente estudo foram recrutados doentes com cancro do pulmão diagnosticados com diferentes tipos de cancro do pulmão no estádio IV e tratados com inibidores da tirosina cinase ou platina(75 mg/m2) e docetaxel (75 mg/m2)-basedchemoterapia. Os pacientes foram internados no Hospital do Povo Subei entre janeiro de 2013 e dezembro de 2014.

o estudo foi aprovado pelo Comité de Ética do Subei People’s Hospital. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante. Este estudo está em conformidade com o “código de Ética da Associação Médica Mundial” (Declaração de Helsínquia, 1964).Os 111 pacientes incluíam 90 homens(44-82 anos de idade) e 21 mulheres (40-75 anos de idade). As características do doente estão indicadas no quadro I. foram identificados um total de 56 adenocarcinoma, 21SCC, 32 carcinomas do pulmão de células pequenas e 2 carcinomas adenosquâmicos.Os doentes envolvidos corresponderam aos seguintes critérios:: Karnofskyscore com uma esperança de vida >60 anos > 3 meses, sem doenças do sistema imunológico, electrocardiograma normal, fígado normal e função infantil, e sem tratamento anti-tumoral no prazo de um mês antes do estudo. Os casos tratados com inibidores da tirosina cinase foram do tipo do adenocarcinoma.

as amostras de sangue foram colhidas em todos os pátios e os soros foram separados e congelados até análise subsequente.As amostras de efusão Pleural foram colhidas seguindo os procedimentos aprovados e foram examinadas citologicamente e processadas para aimunohistoquímica.

imunohistoquímica

amostras de tecidos tumorais (focos primários) foram processadas para imunohistoquímica para detecção de CK19, e-cadherina evimentina. As amostras de tecido de focagem primária foram fixadas em formalina e reunidas em blocos parafínicos. Foram utilizadas várias secções (4 µm) de eachsample para a análise imunohistoquímica. As amostras estavam manchadas com hematoxilina e eosina. Os anticorpos Anti-CK19, anti-e-cadherin andanti-vimentin foram adquiridos da TIYO BiotechnologyCorporation (Shanghai, China). Anticorpo policlonal anti-CK19 do coelho(número de catálogo. Z98123) foi usado em uma diluição de 1: 50; anti-e-cadherin ck19 coelho policlonal (catalog No. O anticorpo Z86603) foi utilizado numa diluição de 1: 100; e anticorpo policlonal anti-vimentin CK19rabbit (número de catálogo. Z40651) foi usado na adilução de 1: 500, seguido de incubação com anti-IgG conjugada com rábano-rábano (Beijing CellChip Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China) em uma diluição de 1:100. O desenvolvimento de cores foi realizado utilizando um substrato de 3,3′ – diaminobenzidina.

o aparecimento de partículas Tanas na membrana celular e de citoplasma foi considerado positivo para a CKl9, a e-cadherina e a vimentina, respectivamente. Os resultados imunohistoquímicos foram confirmados por dois patologistas usando um método de dupla ocultação.

Marcador de análises

Um Roche E601 Cobas automática chemiluminescenceimmunoassay analyzer (Roche Diagnostics, Basel, Suíça) wasused para medir séricos de CEA, CA125, neurônio-enolase específica (NSE),α-fetoproteína (AFP) e CYFRA21-1 em soros de doentes e pleuraleffusions. CYFRA21-1 >3,3 ng/ml, NSE >15.2 ng/ml, CEA >5.0 ng/ml, CA125 >35.0 ng/ml e AFP >7 ng/ml foram consideredpositive valores.As células tumorais induzidas por TGF-β1 foram isoladas a partir de tecidos de focos primários, provenientes dos doentes. As células primárias foram isoladas do tecido tumoral primário e do derrame pleural do mesmo doente e foram cultivadas. As células foram isoladas em duas etapas: I) centrifugação através do meio de separação linfocitária (gravidade específica de 1.077), seguida de Cultura no meio RPMI-1640 com 20% de soro fetal bovino (Beijing Lably Biotechnologicorporation, Pequim, China) por 2 dias. ii) subseqüentemente 40/20%Percoll (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pequim, China) foi usado como centrifugação de segunda etapa para separar as células. As células recolhidas foram novamente cultivadas no meio de cultura inRPMI-1640, contendo 20% de soro fetal bovino, e incineradas a 37°C Sob 5% de atmosfera de CO2 até 70-80% de confluência. As células foram tratadas com TGF-β1 (compradas de Shanghai Kexing Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) a 5 ng / ml for24 h. as células foram então lavadas e processadas. A imunohistocemicalanálise da e-cadherina, CK19 e vimentina, foi realizada antes e após o tratamento com TGF-β1, como descrito acima. A presença de orbsence destes marcadores foi avaliada como positiva ou negativa,respectivamente.A análise estatística de 5771

P <0,05 foi considerada estatisticamente significativa.

resultados

características do doente

os 111 doentes incluíram 90 homens e 21 mulheres, com uma distribuição etária semelhante (40-80 anos). Os doentes foram diagnosticados com cancro do pulmão em fase IV. Histologicamente, a maioridade dos casos foi o tipo de adenocarcinoma, seguido de CPPC e CCP, botina os doentes do sexo masculino e feminino (TableI). Só houve dois casos de carcinoma adenosquâmico nesta amostra de doentes. A maioria dos doentes recebeu tratamento com quimoterapia, com base na quimioterapia à base de platina e docetaxel,enquanto que os doentes com ganho de função do receptor do factor de crescimento epidérmico receberam tratamento com inibidor da tirosina cinase (TKI) (Gefitinib). Apenas um pequeno número de doentes (5 homens e 1 mulher)não recebeu estas terapêuticas devido a restrições financeiras.

Histologia do tumor primário

tecidos tumorais de 111 doentes foram examinadosimunoistocemicamente para a expressão CK19. Embora tenha sido observada uma expressão elevada de Ck19 em certos cancros pulmonares, é provável que a perda de CK19 esteja associada com EMT (17). No presente estudo, a expressão CK19 estava ausente em muitos tumores de CPPC,> 50% em homens e 100% em mulheres. Como tal, a expressão CK19 foi relativamentecresumida nos tumores SCLC em comparação com outros neoplasias lungcancers (Fig. 1). Dos adenocarcinomas, aproximadamente 31% dos tumores de pacientes do sexo masculino foram negativos para CK19, o que foi muito menor para as mulheres (7%).No geral, os tecidos tumorais SCLC mostraram maior probabilidade de características Emtcharacterísticas (Tabela I). Verificou-se uma redução aparente na proporção de tumores expresserprimários CK19 negativos, bem como células de efusão pleural após a Timerapia, em comparação com patientumores não tratados ou tratados com quimioterapia, em todos os tipos de cancro do pulmão (Fig. 2).

níveis de CYFRA21-1

níveis séricos e de derrame pleural os níveis de CYFRA21-1 apresentavam marcadores importantes de malignidade para muitos tipos de cancro, em particular para o cancro do pulmão. Uma vez que o CYFRA21-1 está fragmentado do CK19, examinámos os níveis de soro e de efusioncyfra21-1 pleural em função da perda de expressão do CK19 nas células de efusão pleural. Os resultados mostraram que quando o CK19 foi expressado fortemente no foco primário e nas células de efusão pleural, os níveis de CYFRA21 – 1 eram elevados e quando a expressão CK19 foi perdida nos tumoresrimários e/ou nas células de efusão pleural, os níveis de CYFRA21-1 diminuíram significativamente em todos os tipos de cancro (Fig. 3). Adicionalmente, os níveis de CYFRA21-1 foram muito mais elevados no soro e efusão pleural de doentes com tumores SCC positivos ao nível do CSC em comparação com outros tipos de tumores(Fig. 2). Os elevados níveis de cifra21-1 no soro do doente SCC e efusão pleural provavelmente reflectem a forte presença de CK19 em tumores positivos(Fig. 1). Os resultados também sugeriram que os níveis de cyfra21-1 doserum foram elevados apenas marginalmente nos bancosclungares em comparação com os níveis de base benignos (1,3–2,6 ng/ml), com excepção do SCC, onde o aumento foi muito superior ao nível normal (Fig. 3). No entanto, os níveis de CYFRA21-1 foram muito elevados acima do intervalo benigno (6, 5–35 ng/ml)(18) na efusão pleural dos doentes com cancro do pulmão, sugerindo que a medição da efusão pleural do CYFRA21-1 é um marcador tumoral óptimo.

outros marcadores séricos

marcadores de malignidade tumoral incluindo CA125, CEA,NSE e AFP foram medidos no soro de alguns dos doentes e houve uma variação considerável entre os doentes e os níveis.Assim, para os doentes com CDA, a média de CA125, CEA, NSE e AFPwas 23.6±10.9, 48.3±39.7, 10.1±2.4, e 2, 1±0, 6, respectivamente. Forpatients with SCC, the average of CA125, CEA, NSE and AFP was57.1±31.5, 5.6±2.7, 20.8±2.5, e 2, 6±0, 4 respectivamente, nenhum deles foi significativamente diferente do intervalo normal (Fig. 4).

indução de EMT em focuscells primários por TGF-β1

TGF-β1 quando incubada com tumorcells pulmonares de foco primário criou alterações relevantes para EMT, em muitos casos. Assim, cerca de 40% dos tumores de adenocarcinoma, focuscélulas primárias ck19-positivas foram induzidas a perder a expressão CK19 e submeter-se a EMT byTGF-β1. Esta proporção de tumores foi de 28% para CSC e 50% para CPC(Fig. 5). Assim, focuscells primários SCLC são indutíveis para serem submetidos a EMT por TGF-β1 mais prontamente. Como mencionado acima, as células primárias do CPPC mostram um nível mais elevado de EMT, mesmo sem indução por TGF-β1 (quadro).

outro conjunto de marcadores importantes da EMT é a perda de ofE-cadherina e o ganho da expressão da vimentina. A e-cadherina foi encontrada como negativa em quase 37,5% das células tumorais primárias de adenocarcinoma,52,3% das células tumorais de SCC e 22% das células tumorais de SCLC (Fig. 6), antes de tratar com TGF-β1. O bycontrastrost, a expressão da vimentina nestes tumores foi positiva em 23,2% das células tumorais do adenocarcinoma, 33,3% das células tumorais do SCC e 31,3% das células tumorais do SCLC (Fig. 7). Na sequência do tratamento de células focais primárias de tumores pulmonares com TGF-β1, as perdas de expressão de e-cadherina estiveram sempre associadas a um aumento da expressão de invimentina(Fig. 8). A percentagem de tumores SCC que mostrou esta resposta ao TGF-β1 (alteração de 40% na expressão e-cadherina e de 57% na expressão vimentina) é mais elevada do que a do adenocarcinoma e do CPPC (Fig. 6).

a discussão

o estado de expressão comparativa de CK19 nos tecidos cancerígenos primarilungos e nas efusões pleurais pode ser útil para avaliar a capacidade metastasizante destas células cancerígenas. Assim, as células de efusão pleural do paciente ifa têm um nível mais elevado de compressão negativexpression de CK19 quando comparado com os tecidos de câncer primarilung do mesmo paciente, assume-se que a expressão negativa de Ck19 está associada com invasão e metástase (19). Assim, no presente estudo, uma largeproportion de pacientes com SCLC tumores tinham tecido tumoral com noexpression de CK19 e o derrame pleural as células desses patientsshowed uma falta de CK19 expressão, indicando um alto grau ofmetastasis neste tipo de câncer de pulmão, que é um typicalcharacteristic de SCLC (20). Foram sugeridos vários motivos para a perda da expressão CK19, incluindo a alteração da expressão e o aumento da degradação proteolítica(21).

uma vez que o CYFRA21-1 é um fragmento de CK19, os níveis séricos e de efusão pleural de CYFRA21-1 são considerados importantes marcadores de malignidade para muitos tipos de cancro, em particular para o lungcancer (7,21). No entanto, é difícil ter certaalteração no diagnóstico do cancro, com base nos níveis circulantes de CYFRA21-1, uma vez que existem casos de cancro do pulmão em que os níveis de CYFRA21-1 diminuem, enquanto noutros casos se regista um aumento (7,21).No entanto, a partir dos resultados actuais, os níveis séricos de CYFRA21-1 diminuíram com a maior possibilidade de EMT, uma vez que foi detectada a perda de expressão CK19 em efusões pleurais em comparação com o tecido tumoral primário correspondente. Assim, o nível sérico de CYFRA21-1salong com o estado de expressão CK19 das células cancerígenas do focinho primário e das efusões pleurais pode identificar positivamente a capacidade de invasion e metástase das células cancerígenas do pulmão. Outros marcadores, incluindo CA125, CEA, AFP e NSE, que são habitualmente utilizados para o diagnóstico de cancro, não foram consistentes nesta avaliação.

a capacidade metastasizante é concedida às células cancerígenas primáriasatravés da EMT e um dos factores primários que podem induzir a EMT é o TGF-β1. Embora o TGF-β1 funcione normalmente como uminibitor da proliferação de células epiteliais, devido a vias de sinalização alteradas em muitas células cancerígenas, o TGF-β1 actua para melhorar a proliferação de células cancerígenas, incluindo células cancerígenas do pulmão(22). Para além de aumentar o crescimento das células cancerígenas, sabe-se que o TGF-β1 promove a EMT nas células cancerígenas, contribuindo assim para a invasão e metástase das células cancerígenas. Tem sido sugerido que nos estágios iniciais do desenvolvimento tumoral primário em tecidos epiteliais, TGF-β1 atua como um inibidor do crescimento tumoral através da prisão do ciclo celular e apoptose (23,24).No entanto, à medida que a progressão tumoral ocorre, durante as fases posteriores do desenvolvimento tumoral, há inactivação da via de sinalização TGF-ß1 ou regulação aberrante do ciclo celular e as células cancerígenas tornam-se resistentes à inibição do crescimento por TGF-β1(23,24). Nestas condições, o TGF-β1 é utilizado como factor de crescimento pelas células cancerígenas (25). A expressão do mRNA e da proteína do mtgf-β1 foi muito elevada em muitos tipos de cancro, incluindo a do pâncreas, cólon, estômago, pulmão, endométrio, próstata,mama, cérebro e osso (26).

Considerando que a propensão para se submeter a EMT é aumentada na presença de uma citocina como TGF-β1, que é conhecida como elevada em pacientes com cancro do pulmão, examinamos a Emissibilidade das células de foco primário, ex vivo, por TGF-β1.Dependendo do marcador EMT empregado, os tumores SCLC e SCC tinham uma maior capacidade de se submeterem a TGF-β1-induzida EMT. Focuscells primários SCLC são indutíveis para serem submetidos a EMT por TGF-β1 mais prontamente, se weconsider perda de expressão CK19. Existe, de fato, um maior grau de EMT, em termos de falta de CK19 em células tumorais primárias SCLC. Bycontrast, células primárias de tumor SCC respondem pela perda de e-cadherin e expressões elevadas de vimentina. A regulamentação da E-cadherina, juntamente com a regulamentação da N-cadherina, caracteriza o processo EMT e estas alterações na expressão destas proteínas são associadas à aquisição de resistência à apoptose andanoikis (27,28).

Em resumo, os resultados do presente estudo suggestthat a invasão e metástase de câncer de pulmão de células tumorais pode beassessed por ter uma imagem completa do soro CYFRA21-1 togetherwith a CK19 expressão de status do foco principal células e pleuraleffusion. Esta avaliação pode ser melhorada através da análise da propensão das células focais primárias isoladas para a TME induzida por undergoTGF-β1 na cultura celular.

agradecimentos

os autores gostariam de reconhecer a assistência técnica do Dr. Yong Chen e do Dr. Jixin Jiang.

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