industrial anaerobe Clostridium acetobutylicum usa polyketides para regular a diferenciação celular

estirpes Bacterianas e media

C. acetobutylicum ATCC 824 foi cultivado em uma câmara anaeróbia (Coy Laboratório de Produtos), contendo uma atmosfera de 97% de azoto e hidrogénio a 3%. 2xYTG medium67 continha 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levedura, 5 g/L NaCl e 10 g / L de glucose (salvo indicação em contrário) com o pH ajustado para 5.2 para os meios líquidos e 5,8 para os meios sólidos (também contendo ágar de 15 g/L). Clostridial meio de crescimento (CGM)68 contidas 30 g/L de glicose (excepto indicação em contrário), de 6,25 g/L extrato de levedura, 2,5 g/L de sulfato de amônia, de 1,25 g/L de NaCl, 2,5 g/L asparagina, 0,95 g/L de fosfato monobásico de potássio, 0,95 g/L de fosfato dibásico de potássio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, de 13 mg/L de sulfato de manganês heptaidratado, e 13 mg/L de sulfato de ferro heptaidratado com o pH ajustado para 6,4. P2 medium69 continha 80 g/L de glucose( salvo indicação em contrário), 1 g/L de extracto de levedura, 2,2 g/L de acetato de amónio, 0.5 g/L de fosfato de potássio monobásico, 0,5 g/L de potássio, sulfato de fosfato dibásico, 0,2 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 1 mg/L para-aminobenzoic acid, 1 mg/L de tiamina cloridrato, 10 µg/L de biotina, 10 mg/L de sulfato de manganês heptaidratado, 10 mg/L de sulfato ferroso heptaidratado, e 10 mg/L de NaCl, com o pH ajustado para 6,4. O meio basal clostridiano (CBM)70 continha 10 g/L de glucose, 0, 5 g/l fosfato monobásico de potássio, 0, 5 g/L fosfato dibásico de potássio, 4 g/L de triptona, 0.2 g/L sulfato de magnésio hepta-hidratado, 10 mg/L sulfato de manganês hepta-hidratado, 10 mg/l sulfato ferroso hepta-hidratado, 1 mg/L ácido para-aminobenzóico, 1 mg/L cloridrato de tiamina e 2 µg/L biotina com o pH ajustado para 6.9. Para placas de CGM sólidas, foi adicionado ágar de 15 g/l. O CBM-S (utilizado para testes de esporulação líquida) era idêntico ao CBM, com excepção da utilização de glucose a 50 g/L, e do CaCO3 a 5 g/L foi adicionado imediatamente antes da inoculação das culturas. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) foi cultivada em meio Luria-Bertani (LB) a 37 °C. Para as estirpes de Clostridium apropriadas, os meios de cultura foram completados com eritromicina (Ery; 40 µg/mL para meios sólidos, 80 µg/mL para meios líquidos) e/ou tianfenicol (Th; 5 µg/mL para meios sólidos e líquidos). A canamicina (Kan; 60 µg/mL) ou o cloranfenicol (Cm; 25 µg/mL) foram adicionados ao meio de cultura de E. coli, conforme indicado. As estirpes de Clostridium e E. coli mantiveram-se em 20% das existências de glicerol v/v armazenadas a -80 °C.

Construção Plasmídica

oligonucleótidos foram fornecidos por tecnologias integradas de ADN (tabela complementar 5). A polimerase (NEB) de perfusão foi utilizada para todas as reacções PCR. Para o isolamento do ADN genómico a partir de C. acetobutylicum ATCC 824, foi utilizado um método de lise alcalina 71. C. O acetobutilicum foi cultivado durante a noite em fase 2xYTG média a estacionária (OD600 > 2.0), tendo sido centrifugados 10 mL de cultura a 3500×g durante 15 minutos (temperatura ambiente). O sobrenadante foi eliminado e o sedimento da célula foi ressuspendido em tampão SET de 5 mL (NaCl de 75 mM, EDTA de 25 mM pH 8, 0, Tris-HCl de 20 mM, pH 7, 5). A lisozima foi adicionada a uma concentração final de 2 mg/mL e a solução foi cuidadosamente misturada. A mistura foi incubada a 37 ° C durante 60 minutos, com uma mistura suave a cada 15 minutos. Após o período de Incubação, foram adicionados 660 µL de tampão de lise (1 m NaOH, 10% W/v SDS) e a solução foi completamente misturada. A Proteinase K foi adicionada a uma concentração final de 0, 5 mg/mL e a solução foi incubada a 55 °C durante 1 h. Após este período de incubação, foi adicionado um volume igual de fenol:clorofórmio (1:1) e a solução foi misturada por inversão durante 5 minutos. A solução foi então centrifugada a 3500×g durante 15 minutos (à temperatura ambiente) e a fase aquosa superior foi descartada por pipetagem. À fase orgânica foi adicionado acetato de sódio 3 M (10% v/v na solução final). Para precipitar o DNA genômico, foram adicionados 2 volumes de etanol e a solução foi misturada. O DNA genômico precipitado foi coletado usando um gancho de vidro, e lavado com 70% de etanol. O ADN lavado foi depois seco sobre o azoto durante 15 minutos, ressuspendido em tampão TE baixo (Tris de 10 mM, EDTA de 0,1 mM, pH 8,0) e dissolvido por incubação a 50 ° C.

Para a construção do plasmídeo pKO_mazF_mod (que mais tarde iria servir como um modelo para pKO_pks), primers pKON_Fo e pKON_Ro foram utilizados para amplificar por PCR de uma 5.0 kb região do pKO_mazF template15. Este passo foi necessário para remover uma região de 677 bp da espinha dorsal pKO_mazF, que não conseguimos amplificar através da PCR. O produto de 5,0 kb PCR foi purificado, digerido nas extremidades de 5′ e 3′ usando PshAI, ligado para formar pKO_mazF_mod, e transformado em E. coli TOP10. Clones do transformador foram rastreados por digestão de teste plasmídeo purificado,e sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a sequência do clone final do pKO_mazF_mod. Para a construção do plasmídeo pKO_pks (para exclusão dos pks gene da C. acetobutylicum), um 3.8 kb região que contém colE1, repL, bgaR, e mazF foram PCR amplificados a partir de pKO_mazF_mod usando primers pKO_F e pKO_R. Além disso, os primers UHR_Fo e UHR_Ro, e DHR_Fo e DHR_Ro foram utilizados para amplificar por PCR 1 kb regiões que representam o montante e a jusante regiões homólogas (UHR e DHR) flanqueando o pks gene (CA_C3355) a partir de um C. acetobutilicum ATCC 824 modelo de ADN genómico. O gene de resistência ao cloranfenicol/tianfenicol e o promotor constitutivo (p ptb de C. acetobutylicum) foram amplificados a partir de pKO_mazF_mod utilizando os iniciadores CMR_F e CMR_R (região de 1,1 kb). Estes quatro produtos PCR foram ligados através da Gibson assembly e transformados em E. coli TOP10. Clones do transformador foram rastreados por digestão de teste plasmídeo purificado, e sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a sequência do clone final do pKO_pks. Para a construção do plasmid pAN315 (necessário para a metilação de pKO_pks e pCKO_pks antes da transformação em C. acetobutylicum), 6,4 kb região do plasmídeo pAN172 foi amplificado usando primers pAN1_F e pAN1_R, e um 1.0 kb região contendo canamicina gene de resistência do vetor pCOLA_Duet foi amplificado usando primers KAN_Fo e KAN_Ro. The gel extracted PCR products were ligated via Gibson assembly and transformed in to E. coli TOP10. Clones transformantes foram rastreados por digestão de teste plasmídeo purificado, e sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a sequência do clone final do pAN3. Para a construção de pcko_pks plasmídeos (para a expressão do gene pks sob o promotor constitutivo de crotonase a partir de C. acetobutylicum), primers CPKS_Fo e CPKS_Ro foram usados para a PCR amplificar o 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks gene (CA_C3355) com overhangs apropriados para a montagem Gibson. A coluna vertebral pWIS_empty vector71 (contendo o promotor CRT constitutivo a montante do local de clonagem múltipla) foi amplificada por PCR usando os iniciadores pWIS_F e pWIS_R produzindo um produto de 5,0 kb. The two gel purified PCR products were ligated via Gibson assembly and transformed into E. coli TOP10. Clones transformadores foram rastreados por digestão de teste plasmídeo purificado, e sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a sequência do clone final do pCKO_pks.

para a construção do plasmídeo pET24b_pks, o 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks (CA_C3355) foi amplificado a partir do DNA genômico de C. acetobutylicum usando primers PKS_Fo e PKS_Ro. O pet24b vector duplamente digerido (ecori / XhoI digerido) foi ligado a um produto pks PCR duplamente digerido (ecori/XhoI digerido), e o produto de ligação foi transformado em E. coli TOP10. Clones do transformador foram rastreados por digestão de teste plasmídeo purificado, e sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a sequência do clone final do pET24b_pks.

Electro-transformação da C. acetobutylicum

Antes da transformação em C. acetobutylicum, vetor pKO_pks foi co-transformada com pAN3 em E. coli TOP10 através de eletroporação. Este procedimento permitiu a metilação de pKO_pks necessária para superar o sistema nativo de modificação de restrições ativo em C. acetobutylicum 72. Purificação plasmídica de E. a cultura líquida de coli pKO_pks/pAN3 foi realizada, e a mistura plasmídica resultante foi usada para eletroporações de C. acetobutilicum usando o método anteriormente publicado72 que detalhamos aqui. Para preparar células electrocompetentes, uma única colónia de C. acetobutilicum a partir de uma placa de 2xYTG (com mais de 1 semana de idade) foi atingida pelo calor a 80 °C durante 10 minutos e utilizada para inocular 10 mL de CGM. Depois de incubar durante a noite a 37 °C e de atingir a fase expoencial média (OD600 0, 4-0, 9), utilizou–se uma cultura de 6 mL para inocular 54 mL de 2xYTG fresco. Esta subcultura foi incubada a 37 ° C até atingir OD600 1.2 (~5 h), altura em que a subcultura foi centrifugada a 3500×g durante 20 minutos (4 °C). Após remoção do sobrenadante, o sedimento da célula foi ressuspendido em 20 mL de tampão de electroporação a frio com gelo (EPB; 270 mM de sacarose, 5 mM de NaH2PO4, pH 7.4). As células ressuspendidas foram centrifugadas a 3500×g durante 10 minutos (4 °C), o sobrenadante foi eliminado e o sedimento celular foi ressuspendido em 20 mL de EPB gelado. Após uma última granulação por centrifugação a 3500×g durante 10 minutos (4 °C), o sobrenadante foi eliminado e o sedimento ressuspenso em 2,3 mL de EPB gelado. Esta Re-suspensão final foi utilizada como reserva de células electrocompetentes. As Electro-transformações foram realizadas pela primeira mistura (sobre gelo) de 500 µL de células competentes e ~20 µL de solução de ADN plasmídeo (1-5 µg total) a transformar. A mistura foi transferida para uma cuveta de 0,4 cm de eletroporação, e permitiu incubar no gelo durante 15 minutos. Eletroporações foram realizadas com os seguintes parâmetros: Tensão, 2000 V; capacitância, 25 µF; resistência, Ω infinito. Após a electroporação, as amostras foram ressuspendidas em 1 mL de 2xYTG e transferidas para um tubo contendo 9 mL de 2xYTG. Após mistura por inversão, as culturas puderam recuperar a 37 ° C durante 4 H. as culturas de recuperação foram centrifugadas a 3500×g durante 15 minutos (à temperatura ambiente) e o sobrenadante foi descartado. O sedimento celular foi ressuspendido em 500 µL 2xYTG, e 100 µL foi banhado em placas sólidas de 2xYTG complementadas com o antibiótico apropriado. A placa foi incubada a 37 ° C durante 2-3 dias, e as colónias de transformadores foram submetidas a verificação por PCR.

deleção do gene pks e complementação genética

Ko alvo do gene pks (ca_c3355) em C. o acetobutilicum ATCC 824 foi obtido utilizando o método anteriormente publicado15. Em pormenor, 5 µg de mistura pko_pks/pAN3 plasmídea metilada foi transformada em C. acetobutilicum pelo método acima descrito. A seguir recuperação no líquido 2xYTG médio por 4 h, a célula de pelotas foram coletadas por centrifugação (3500×g, 15 min, temperatura ambiente), em suspensão em 0,5 mL de água doce líquido 2xYTG, e 100 µL da suspensão de células de cultura foi banhado em sólidos 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM β-lactose placas. Sob estas condições de revestimento, apenas as células que foram submetidas ao desejado evento de recombinação homóloga de cruzamento duplo são esperadas para sobreviver. A contra-selecção da coluna vertebral do vector é fornecida pelo promotor indutível de lactose (p bgaL ), que impulsiona o gene da toxina mazF na coluna vertebral do vector pKO_pks. Após este procedimento de revestimento, foram observadas cerca de 10 colónias nas placas de 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mM de β-lactose. Destas 10 colônias, quatro foram duas vezes restauradas e submetidas à verificação da PCR da colônia. Quatro conjuntos de iniciadores foram usados como base para a verificação da PCR da colônia, como detalhado em Figo suplementar. 2.

For generating the pks genetic complementation strain, electroporation of ∆pks C. acetobutylicum with a pCKO_pks/pAN3 plasmid mixture was performed as described above. Após a electroporação e recuperação, as culturas foram revestidas com 2xYTG + 5 µg/mL de Th + 40 µg/mL de meio Ery. Após duas reaquisições em sólidos 2xYTG + 5 µg / mL Th + 40 µg / mL de meio Ery, as potenciais colónias que abrigam pCKO_pks foram rastreadas através da PCR de colónias utilizando primers pCKO_F e pCKO_R.

LC-HRMS metabolomic análise

Para não segmentado metabolomic comparações de tipo selvagem e ∆pks C. acetobutylicum, único colônias de cada cepa foram calor chocado de 80 °C por 10 min e usado para inocular 10 mL de líquido CGM (30 g/L de glicose). Após incubação nocturna (estagnação) até atingir OD600 ~1.0, estas culturas foram utilizadas para inocular 10 mL de CGM líquido (glucose 80 g/L) com um inóculo de 10% para subcultura. Após ~5 h (OD600 ~1.0) de crescimento estagnado, as subculturas foram utilizadas para inocular fermentações quadruplicadas do frasco (70 mL de CGM, 80 g/L de glucose + 5 µL de anti-espuma 204, 3% de inóculo) agitadas através de barras de agitação magnética. O carbonato de cálcio (6 g/L) foi complementado com o meio de fermentação para tamponamento do pH. Toda a cultura foi realizada a 37 ° C. Cerca de 5 µg/mL foi incluída em todas as culturas de ∆pks, com excepção da cultura de fermentação final, uma vez que certos antibióticos são conhecidos por perturbar as fases de fermentação ABE. Foram colhidas amostras de caldo de fermentação (1 mL) de cada replicado durante a fase estacionária inicial e extraídas com 3 mL de 2:1 metanol clorofórmio. As misturas foram indexadas, separadas por centrifugação (2700×g, 10 min), e a camada inferior rica em clorofórmio foi transferida para um frasco de vidro. Estes extratos orgânicos foram secas com gás nitrogênio, em suspensão em 100 µL de metanol e 10 µL foi injetado em um Agilent Technologies 6520 Precisas de Massa QTOF LC-MS instrumento equipado com um Agilent Eclipse Plus coluna C18 (4.6 × 100 mm). Foi utilizado um gradiente linear de 2-98% de CH3CN (vol/vol) superior a 40 min em H2O com ácido fórmico a 0,1% (vol/vol) a um caudal de 0,5 mL/min. The metabolomic analysis platform XCMS16 (The Scripps Research Institute) was used to compare the metabolomes of wild-type and ∆pks strains based on the quadruplicate LC-HRMS data. MS peaks unique to ∆pks (Fig. 1-A) foram identificados utilizando os seguintes parâmetros: valor p < 0, 01, alteração da dobra > 10, 0, intensidade de pico > 5000.

fermentações de Biorreactores

para comparar perfis de fermentação ABE de tipo selvagem e ∆pks C. foram realizadas fermentações de acetobutilicum e biorreactor em Biorreactores dasgip (4 × GPI 100 vasos, sistema Dasgip Bioblock) com 500 mL de volumes de trabalho. Culturas nocturnas (10 mL de CGM, 30 g/L de glucose, estagnadas, 34 °C) inoculadas com choques térmicos, as colónias individuais de C. acetobutilicum foram cultivadas até atingirem OD600 ~1. Foi então utilizado um inóculo de 10% para iniciar uma subcultura (30 mL de meio P2, 80 g/L de glucose, estagnação, 34 °C), e a subcultura foi incubada até atingir OD600 ~1. As subculturas de 30 mL foram então transferidas assepticamente para Biorreactores individuais dasgip pré-carregados com 500 mL de meio P2 (glucose 80 g/L, 100 µL anti-espuma 204, 34 °C). As fermentações foram permitidas para prosseguir por 54 h com amostragem periódica para medições de densidade óptica, análise do produto de fermentação, e quantificação de compostos 1, 2 e 3. A temperatura manteve-se a 34 °C durante toda a fermentação, a agitação foi fornecida pela agitação a 200 rpm, e o pH foi mantido acima de 5,0 através da adição automática de 3 M NH4OH. Para manter as condições anaeróbias, o gás nitrogênio isento de oxigênio foi gaseado a uma taxa de 2 sL/h durante a fermentação. Para a quantificação dos compostos 1, 2 e 3, 1 mL de caldo de fermentação foi misturado com 3 mL de acetato de etilo, indexado, separado por centrifugação (2700×g, 10 min, temperatura ambiente), e isolada a camada orgânica superior. A camada orgânica foi secada pelo rotary evaporação, em suspensão em 200 µL de metanol e 20 µL foi injetado em um Agilent Technologies 6120 Quadripolares LC-MS (com o PAI) instrumento equipado com um Agilent Eclipse Plus coluna C18 (4.6 × 100 mm). Foi utilizado um gradiente linear de 2-98% de CH3CN (vol/vol) superior a 40 min em H2O com ácido fórmico a 0,1% (vol/vol) a um caudal de 0,5 mL/min. Os compostos 1, 2 e 3 foram identificados por absorção UV (240 nm), como demonstrado na Fig. 1b, e foram quantificados pela área de pico integrada (absorvância a 240 nm).

procedimentos analíticos de fermentação

um espectrofotómetro foi utilizado para determinar as densidades celulares medindo a densidade óptica a 600 nm (OD600). Um sistema UFLC de proeminência de Shimadzu equipado com uma coluna Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm) foi usado para analisar C. caldo de fermentação de acetobutilico para a concentração de glucose e produtos de fermentação (acetato, butirato, lactato, acetona, butanol e etanol). As amostras de caldo de fermentação (1 mL) foram primeiro granuladas por centrifugação a 10 000×g durante 3 minutos, seguidas de filtração do sobrenadante utilizando um filtro de seringa de PVDF de 0, 22 micron. Amostras de sobrenadante filtrado (20 µL) foram injectadas no sistema UFLC com uma fase móvel de ácido sulfúrico de 0,01 N fluindo a 0,7 mL/min, à temperatura da coluna de 35 °C, e foram cromatografadas durante 35 minutos. Analitos foram detectados pelo uso de um detector de índice de refração (usado para quantificar concentrações de glicose, acetato, lactato, butanol e etanol) e um detector de díodos (usado para quantificar concentrações de butirato (208 nm) e acetona (265 nm)).

isolamento e análise ARN-Seq

amostras (10 mL) de caldo de fermentação foram colhidas em triplicado biológico a partir de fermentações do biorreator de tipo selvagem e ∆pks C. acetobutylicum 26 h após inoculação. As amostras foram centrifugadas (4000×g, 10 min, 4 °C) e os pellets foram ressuspendidos e armazenados em reagente celular RNAprotect (Qiagen). O RNA Total foi extraído utilizando um mini Kit RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Foi efectuado um tratamento on-columnase utilizando DNase i (Sem RNase) (NEB). RNA quality control, library construction, and library sequencing were performed by the University of California-Berkeley QB3 Functional Genomics Laboratory and Vincent J. Coates Genomic Sequencing Laboratory. A qualidade e concentração do ARN foram avaliadas utilizando um nanochip num Bioanalisador Agilente 2100. As bactérias 16S e 23S rRNA foram removidas usando um Kit RiboZero (Illumina). O mensageiro RNA resultante (mRNA) foi convertido para uma biblioteca RNA-Seq usando um kit de construção de biblioteca mRNA-Seq (Illumina). O sequenciamento da biblioteca RNA foi realizado em uma Illumina HiSeq4000 com 50 BP de leitura única. As leituras sequenciadas (50 bp) foram processadas e mapeadas para o genoma do C. acetobutylicum ATCC 824 (NCBI accession NC_0030.1 e NC_001988.2 ) usando o genômico CLC Workbench 9.0 com parâmetros padrão. Lê-se que não se alinharam unicamente ao genoma foram descartados. As diferenças na expressão genética entre o tipo selvagem e ∆pks C. acetobutylicum foram calculadas usando o mesmo software. Os Genes foram considerados diferencialmente expressos com valor p < 0, 003 (com base num teste t não emparelhado, n = 3) e |alteração normalizada da dobra |> 2, 0. Correções de taxa de descoberta falsas em valores p foram calculadas em CLC Genomics Workbench 9.0 usando um método publicado 73. Os resultados da análise RNA-Seq são apresentados em dados suplementares 1. A análise de cordas 30 foi realizada para determinar interações proteína–proteína putativa entre os genes de expressão diferente revelados pela análise RNA-Seq.Os ensaios de comparação de fenótipo

os ensaios de esporulação líquida foram realizados com pequenas modificações74. Foram colhidas amostras de culturas líquidas biológicas triplicadas após 5 dias de incubação (30 mL de CBM-S, 37 °C). A 20 µL de amostras foram calor chocado (80 °C, 10 min), diluições (101-106) foram vistos no 2xYTG placas, e colônias foram enumerados após 30 h de incubação (37 °C) para calcular o número de resistentes ao calor de unidades formadoras de colônia (ufc/mL). Para a complementação química de ∆pks no ensaio de esporulação líquida, a clostrienose purificada (concentração final de 3,5 µM) foi suplementada em culturas CBM-S de ∆pks C. acetobutylicum no momento da inoculação. Uma vez que o composto 3 foi adicionado como solução concentrada em metanol, o volume equivalente de metanol (60 µL) foi adicionado a todas as outras culturas de doseamento de esporulação líquida (tipo selvagem e ∆pks não complementados) para controlar este efeito.

para os ensaios de esporulação sólida, foi utilizado um método anteriormente descrito 75 com algumas modificações. Em detalhe, as colónias individuais em estado de choque térmico (80 °C, 10 min) foram cultivadas em meio líquido (10 mL de CGM, 37 °C) durante 24 h. as culturas foram diluídas por um factor de 106 e revestidas com MBC sólida. A amostragem foi realizada 1, 2, 3, 4 e 6 dias após o revestimento inicial. Para a amostragem, foram combinadas três colónias individuais e ressuspendidas em 60 µL de CGM líquido. 20 µL da suspensão colônia mistura foi, então, o calor chocado (80 °C, 10 min), diluições (101-106) foram vistos no 2xYTG placas, e colônias foram enumerados após 30 h de incubação (37 °C) para calcular o número de resistentes ao calor de unidades formadoras de colônia (ufc/colônia). Todas as amostras foram realizadas como triplicados biológicos.Os ensaios de acumulação de Granulose foram realizados através da coloração de iodo 53. Culturas líquidas de meio log (OD600 ~0.6) (P2, 37 °C) foram banhadas em meio sólido de 2xYTG com níveis elevados de glicose (50 g/L) para permitir a produção de granulose. As placas foram incubadas a 30 ° C durante 4 dias, altura em que foram manchadas por exposição a um leito de cristais de iodo durante 10 minutos. As placas foram então autorizadas a parar por 10 minutos antes da imagem. No caso da complementação química de ∆pks no ensaio de acumulação de granulose, a clostrienose purificada (concentração final da placa 4,0 µM) foi incorporada em placas sólidas de 2xYTG antes de ser tratada a cultura de ∆pks. Uma vez que a clostrienose foi adicionada a placas de 2xYTG como solução concentrada em metanol (misturada no meio fundido antes da solidificação), o volume equivalente de metanol (6 µL) foi adicionado a todas as outras placas de 2xYTG utilizadas nos ensaios de acumulação de granulose para controlar este efeito.

colónias individuais de C. acetobutilicum cultivadas em placas CBM durante 48 h (37 °C) foram vistas e fotografadas utilizando um microscópio de dissecação Leica MZ16 f equipado com uma câmara Leica DFC300 FX.Os ensaios de disseminação do óleo foram realizados como descrito anteriormente em 76,77,78. Em pormenor, encheu-se um copo de vidro de 400 mL (7,5 cm de diâmetro interno) com 300 mL de água, adicionou-se uma gota de óleo parafínico de 10 µL e permitiu-se que se espalhasse numa película fina na superfície da água durante um período de 5 minutos (~25 mm de diâmetro). Foram preparadas soluções de surfactina, clostrienose purificada e um tampão de fosfato de potássio com o pH e a concentração indicados (preparado em tampão de fosfato de potássio de 10 mM). Cerca de 10 µL de amostra foi cuidadosamente adicionado ao centro do filme de óleo, e o efeito sobre o filme de óleo foi observado. Espera-se que as amostras com actividade surfactante formem zonas de compensação circulares estáveis na película de óleo, com uma actividade surfactante mais potente correspondente a zonas de compensação maiores (ou dispersão completa da película de óleo para uma actividade surfactante muito elevada). Testes de queda foram realizados 77, 79, 80. Circular micropoços (8 mm de diâmetro interno) dentro da tampa de poliestireno de 96-placa de micropoços (12.7 × 8.5 cm) foram revestidos com uma fina camada de parafina, óleo da lâmpada adicionando 2,0 µL de parafina lâmpada de óleo para cada bem, e permitindo que a gota se espalhar uniformemente sobre os micropoços ao longo de um período de 1 h. Foram preparadas amostras de surfactina, clostrienose purificada e controlo do fosfato de potássio, tal como para os ensaios de espalhamento de óleo. Cerca de 5 µL de amostra foi cuidadosamente adicionada ao centro do microwell. Após 5 minutos, observou-se a forma e o grau de propagação da gota. Embora se espere que os controlos dos tampões formem esferas estáveis na superfície do microwell, espera-se que as amostras que contêm surfactante colapsem e se espalhem sobre a superfície do microwell, com uma actividade surfactante mais potente correspondente a um grau mais elevado de espalhamento de gotículas.

purificação e Análise in vitro da proteína PKS

para purificar a proteína PKS de 6 marcas para análise in vitro, o pET24b_pks foi transformado em E. coli BAP1. Uma única colônia foi inoculada em 10 mL de LB + de 50 µg/mL de canamicina (Kan) para o crescimento de noite a 37 °C. Cerca de 7 mL de pernoite cultura foi utilizado para inocular 700 mL de LB + de 50 µg/mL Kan, e a cultura foi abalada a 240 rpm e 37 °C, até atingir OD600 de 0.5. Após a formação da cultura durante 10 minutos, foi adicionado tio-β-d-galactoside (IPTG) isopropilo a uma concentração final de 0.1 mM para induzir a expressão da proteína, e a cultura foi incubada a 16 °C por 16 h. As células foram colhidas por centrifugação (5500×g, 4 °C, 20 min), em suspensão em 25 mL de tampão de lise (25 mM de HEPES, pH 8.0, 0,5 M de NaCl, 5 mM de imidazol), e lisadas por homogeneização sobre o gelo. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (17.700×g, 4 °C, 60 min) e a resina de agarose Ni-neta foi adicionada ao sobrenadante (cultura de 2 mL/L). A mistura foi nutrida a 4 ° C durante 1 h, carregada numa coluna de fluxo gravitacional, e a proteína PKS foi eluída com concentrações crescentes de imidazol no tampão a (20 mM de HEPES, pH 8,0, 1 mM de ITT). A proteína PKS purificada estava concentrada e o tampão trocado em tampão a + 10% glicerol utilizando um concentrador centrífugo de Vivaspina. Alíquotas de proteína PKS purificada foram aliquotadas e flash congelado em nitrogênio líquido. O rendimento proteico aproximado foi de 5 mg / l (203 kDa).

um ensaio de carga PKS com substrato marcado com 14C contido, num volume total de 15 µL, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.Ácido 2-14C-malónico (0,1 µCi), MatB de 10 µM, PKS de 17 µM e HEPES de 50 mM, pH 8.0. Após 2 h de incubação a 25 °C, As amostras foram extintas adicionando um volume igual de 1× tampão de amostra SDS. Após a análise da página SDS com um gel TGX de 4-15% (critério), o gel foi seco durante 2 h a 50 °C e exposto num ecrã de fósforo de armazenamento (20 × 25 cm; Dinâmica Molecular) durante 5 dias. A proteína marcada radioactivamente foi fotografada num tufão 9400 fosforimager (modo de armazenamento do fósforo, resolução de 50 µm; Biociências de Amersham).

para os ensaios in vitro de produtos (50 µL) da proteína PKS, incubou-se 8 µM de PKS com malonil-CoA (2 mM) em tampão fosfato (100 mM, pH 7.0) à temperatura ambiente durante 2 h para gerar o composto 4, identificado por comparação com um padrão químico. O NADPH (2 mM) foi adicionado ao ensaio para gerar compostos 5 e 6, ambos identificados por comparação com os padrões químicos. Após incubação, as misturas de ensaio foram extraídas duas vezes com 100 µL de acetato de etilo a 99%/1% de ácido acético (v/v). Os extratos orgânicos foram secas e em suspensão em 100 µL de metanol e 10 µL foi injetado em um Agilent Technologies 6120 Quadripolares LC-MS (com o PAI) instrumento equipado com um Agilent Eclipse Plus coluna C18 (4.6 × 100 mm). Foi utilizado um gradiente linear de 2-98% de CH3CN (vol/vol) superior a 40 min em H2O com ácido fórmico a 0,1% (vol/vol) a um caudal de 0,5 mL/min. A análise LC-HRMS dos extratos de doseamento foi realizada em uma tecnologia Agilent 6520 precisão de massa QTOF LC-MS instrumento equipado com um Eclipse Agilent mais coluna C18 (4.6 × 100 mm) utilizando o mesmo gradiente do solvente e o mesmo caudal acima descritos.

disponibilidade de Dados

RNA-seq dados gerados neste estudo foram depositados na ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) sob o número de entrada de E-MTAB-6019. Todos os outros dados relevantes estão disponíveis dos autores a pedido.