planta e o patógeno
comum de gelo da planta (Mesembryanthemum crystallinum L.) é cultivado em estufa, como descrito por Kuźniak et al. . Após o aparecimento do terceiro par de folhas, um conjunto de plantas foi irrigado com 0,4 m NaCl para induzir o metabolismo ácido Crassulaceano (plantas CAM), enquanto outro foi irrigado com água da torneira (plantas C3). Após 12 dias, a indução de CAM nas plantas tratadas com NaCl foi confirmada através da medição do ∆ malato diurno na seiva das células da folha. Posteriormente, as folhas dos 2º pares de folhas das plantas C3 e CAM foram inoculadas com Botrytis cinerea de acordo com Kuźniak et al. .
Clorofila a imagens de fluorescência
A versão Mini de um exame de Imagem-PAM Clorofila Fluorímetro da Série M (Walz, Effeltrich, Alemanha) equipado com uma folha de titular foi utilizada para gravar imagens de fluorescência (Imagem-PAM-M série Clorofila Fluorímetro) . O fluorômetro é um modelo de clipe de folha para aplicações de campo. O Suporte de folha garante que a folha é mantida horizontal para a fonte de luz para evitar a iluminação heterogénea sobre diferentes áreas da amostra de folha. As posições de amostragem foram escolhidas para serem igualmente espaçadas ao longo do eixo médio, no entanto, diferiam ligeiramente em relação a qualquer folha devido ao seu tamanho e morfologia, e à técnica de colocação das folhas no suporte. Para identificar apenas os efeitos do stress biótico e evitar a introdução de artefactos no procedimento de medição da fluorescência clorofila, não foram aplicadas às folhas quaisquer marcas de referência que permitissem a referência da imagem da folha. Fluorescência clorofila a partir de folhas de plantas de gelo comuns foi obtida através da definição de área de interesses (ferramenta AOI) usando o software Imaging Win 2.41 A.
com a imagiologia-PAM, o actual rendimento de fluorescência (Ft) foi continuamente monitorizado. As plantas foram adaptadas ao escuro durante 20 minutos. Após a aplicação de um pulso de saturação, foram determinados o rendimento de fluorescência de nível escuro (Ft = F0) e o rendimento máximo de fluorescência (Fm). O rendimento quântico máximo PSII, Fv/Fm, e os rendimentos quânticos da dissipação de energia regulada e não-regulada em PSII, Y(NPQ) e Y(NO) foram fotografados. Fv/Fm foi calculado de acordo com a equação: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) foi calculado de acordo com Kramer et al. pela fórmula: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0-1)). Y (NO) foi calculado de acordo com Kramer et al. pela equação: Y(no) = 1/. O processo de geração de imagens fornece pseudo-cor (cor indexada modo) imagens de material biológico com uma resolução de 640 × 480 pixels correspondentes ao campo de vista das dimensões físicas 32 × 24 mm.
infectado deixa de C3 e CAM plantas foram levadas para chl uma análise por fluorescência no ponto de inoculação e 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 e 72 h após a inoculação. Chl foi medida uma fluorescência para as folhas anexadas do segundo par de folhas a partir de três plantas C3 e CAM provenientes de duas repetições independentes do cultivo de plantas. Cada folha utilizada para análise foi analisada separadamente em todos os pontos temporais (Fig. 1). Foram processadas séries representativas de nove imagens (uma para cada ponto Temporal) de Y(NO), Y(NPQ) e Fv/Fm Para As ice plants C3 e CAM, a fim de medir as alterações destes parâmetros numa área seleccionada de lâmina de folha rastreada ao longo do tempo. Para comparação, os dados médios de Y(NO), Y(NPQ) e Fv/Fm foram obtidos a partir de todas as regiões de folhas representadas na figura. 2 foram obtidos. Os resultados do alinhamento da imagem e a medição da patinação espaciotemporal da propagação do estresse biótico nas folhas com o método proposto foram exemplificados em imagens Y(NO).
exemplo de imagens do rendimento quântico da dissipação de energia não regulada em folhas de plantas de gelo comuns. Aplica–se aos parâmetros fluorescentes PSII Y(n. o) de C3 (A–d) e CAM (e-h). O fragmento de folha contém o local de inoculação do patogéneo e os sintomas de propagação de stress.
exemplo de imagem de C3 folha de planta de gelo comum com regiões selecionadas de interesse. Feitos manualmente seleções no firmware editor de cobrir os infectados (1), symptomless (2), bem como a nervura central áreas (3)
alinhamento da Imagem
O mecanismo de PAM imagem de coleta de dados em tempo seqüência de resultados em móveis da folha fragmento no campo de visão entre os pontos de tempo (Fig. 1). Devido à mudança de posição da folha tais características como o midrib, e os locais da inoculação têm a localização e orientação diferentes. Além disso, o efeito da escala pode ser observado. Para avaliar adequadamente a propagação de tensões, os campos de visão devem ser sincronizados mutuamente assumindo um deles como uma imagem de referência (fixa) e o resto das imagens a ser alinhado com o fixo. Esta abordagem é conhecida na imagem médica como registro de imagem . A tarefa básica de registo das imagens fluorescentes consiste em encontrar a transformação “similaridade” que consiste numa rotação, tradução e escala adequadas. A curvatura da superfície da folha e a dobragem das folhas do stress ocorrem apenas em regiões locais de imagens individuais e são de menor importância para o alinhamento global da imagem. Podem ser compensados na fase de pós-processamento do registo por transformações não lineares, como, por exemplo, placas finas, curvas de superfície e mapeamentos de demónios .
as imagens de fluorescência são tomadas como uma série de imagens em intervalos de tempo predefinidos de aproximadamente a mesma região da folha. Os elementos característicos da pilha de imagens considerada representam principalmente as veias das folhas. No entanto, eles são pouco distinguíveis do conteúdo da imagem devido ao contraste limitado, bem como moda de cor da imagem PAM. As áreas de sintomas de estresse que dominam visualmente o conteúdo podem mudar entre imagens em uma única série. Em tal situação, o registo automático falharia.
os métodos mais populares e automáticos de estado da arte são baseados na comparação da intensidade da imagem com algumas métricas de correlação (métodos baseados na intensidade) ou dependem da pesquisa nas imagens fixas e em movimento para a correspondência entre características de imagem selecionadas, tais como pontos, linhas e contornos (métodos baseados em recursos) . Nenhuma destas abordagens permite o registo adequado de imagens de fluorescência PAM de ice-plant comum, o que foi verificado e mostrado nos exemplos incluídos em materiais suplementares (ficheiro adicional 1). Os resultados apresentados confirmam que a razão para o insucesso dos registos automáticos é o forte obscurecimento das regiões de imagem com características preservadas por alterações dinâmicas no conteúdo da imagem causadas pela infecção do tecido da folha. Os testes dos métodos populares foram realizados tanto pelo Estimador de registro em Matlab quanto no ambiente de Fiji .
the algorithm of PAM image registration was designed in Matlab environment based on the set of control points selected manually by an expert. Para definir os pontos de controlo correspondentes em cada imagem, foi aplicada a função cpselect da ferramenta de Selecção do ponto de controlo a partir da caixa de ferramentas de processamento de imagens. As imagens foram editadas em pares, incluindo uma imagem fixa e uma imagem em movimento. A primeira imagem adquirida logo após a inoculação do patógeno foi assumida como uma imagem fixa (de referência). Através do mapeamento interativo de pontos, o usuário pode apontar não só os contornos visíveis dos nervos, mas também outros elementos característicos, como o ponto de injeção, locais ao longo da propagação do patógeno, bem como as células da bexiga epidérmica mais aparentes (Fig. 3).
pontos de controlo seleccionados pelo perito. Exemplo Y(N) imagens de uma folha fragmento de uma câmara comum de gelo da planta: uma fixa (referência) imagem b imagem em movimento para ser alinhado com o fixado um
Vários pares de ponto de controle locais, distribuídos mais amplamente possível sobre a folha imagem de superfície, são suficientes para alinhar corretamente as imagens da mesma folha de aproximadamente considerado como um corpo rígido. Uma distribuição mais ampla dos pontos de controlo melhora a sensibilidade da correspondência de imagens, mas é limitada pelo campo de visão da imagem recortado após a transformação de alinhamento e pela possibilidade de localização precisa do ponto seleccionado na lâmina de folha. Com esse alinhamento de imagem, a transformada afinada foi realizada usando a função fitgeotrans incluída na caixa de ferramentas de processamento de imagem. Esta transformação foi limitada à versão de “similaridade” (consistindo apenas de tradução, rotação e similaridade) porque a cena no fluorômetro PAM apareceu como não inclinada. As imagens em movimento foram correspondidas à imagem fixa usando a função imwarp. A ilustração gráfica do algoritmo de registo está incluída na Fig. 4.
o diagrama de blocos de Registo afinado e facultativo da curva B aplicado às imagens de fluorescência PAM. \(\left\)—o vetor de pontos de controle na imagem fixa, \(\left^{\left( k \right)}\)—o vetor de pontos de controle na k-ésima imagem em movimento, \(\left^{{\left( {k^{\prime } } \right)}}\)—o vetor de pontos de controle na k-ésima imagem em movimento depois de B-spline de registo
Folhas em diferentes estágios de infecção pode ter uma superfície localmente ondulado ou enrugado como na região marcada no analisados PAM-fluorímetro imagens (Fig. 5a, b), que forma pode potencialmente influenciar a análise adequada do fenômeno de propagação do patógeno. Significa que o método de Registo afinado baseado na transformação geométrica pode não ser suficiente para corresponder imagens de fluorescência PAM em alguns casos de folhas com deformação não-linear aparentemente visível. Por isso, os autores propõem um método de registro em duas fases, onde o registro rígido é afinado seguido de registro B-spline reduzindo deformações não lineares.
exemplo de registos afinados e B-spline para a Imagem Da Planta de gelo C3. um Y(N) imagem depois de PAM aquisição, b a imagem após a rígida afim de transformação, com as setas representam de forma interativa conjunto de vetores de deslocamento utilizado na segunda etapa de inscrição e c forma final após o ponto de controle-base B-spline de registo
A seleção de não-rígida tipo de inscrição explora o fato de que comum gelo, folhas de plantas, representam um pouco de material flexível e pequenas forças de flexão manter as mudanças suaves em uma folha de perfil de superfície. A especificidade desta modificação do registo é que os vectores do campo de deformação da imagem têm de ser impostos interactivamente. Para este propósito, um editor de campo vetorial dedicado foi anexado ao algoritmo. Apenas alguns vectores de deslocamento na imagem em movimento devem ser especificados para registar deformações locais e lisas de uma superfície de folha como Na Figura. 5b.
o algoritmo de Rueckert B-spline foi selecionado para a segunda fase do registro. Sua implementação está disponível na Matlab Central File Exchange como a Ferramenta de registro de Sline Dirk-Jan Kroon.
O B-spline procedimento de registo consiste em duas etapas básicas:
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a Inicialização de uma grade G de pontos de imagem distribuído uniformemente em toda a superfície da imagem com todos os deformação do campo de vectores definido para zero e, em seguida, a computação em uma densa campo de vetores T de deformações na grade G por cúbicos B-interpolação de definir manualmente o controle de ponto de deslocamento vectores \(\left^{\left( k \right)}\). Tanto a grade quanto o campo de transformação associado T são então refinados iterativamente em 4 passos para reduzir o espaçamento dos nós da grade. A transformação T é preparada pela função point_registração a partir da caixa de ferramentas de registro de linha.
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B-transformação da curva de todas as posições de pixels e interpolações bi-cúbicas de componentes de cor na imagem em movimento (registada afinada) \(I_{m}\) de acordo com o campo de deformação suavizado da curva.
precisão do registro de imagem
a precisão do alinhamento de imagem proposto foi realizada pelo quadrado médio raiz (RMS) sobre desvios de n = 15 pontos de controle mostrados na Fig. 3. O deslocamento de cada ponto fixo de controle de imagem \(P_{i}\) avaliado em uma imagem em movimento para o caso com e sem o alinhamento foram ilustrados na figura. 6 como os vetores \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) e \(Q_{i} p_{i} = \ Delta q_{I}\) respectivamente. Os erros de deslocamento RMS de todos os pontos de controle em uma única imagem para os dois casos são expressos em Eq. (1) como \(\Delta r_{\text{rms}}\) e \(\Delta q_{\text{rms}}\).
ilustração da avaliação do erro no registo das imagens PAM. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—ponto de controle na imagem fixa \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—mapeamento do ponto de controle \(P_{i}\) em imagem em movimento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapeamento do ponto de controle \(P_{\text{i}}\) após o registro, \(R_{i} P_{eu} =\Delta r_{i}\)—deslocamento de erro do ponto de controle \(P_{\text{i}}\) após o registro
Os percentuais de residual de deslocamento de \(\delta_{rms}\) após afim tipo de registro, pode ser avaliada por uma imagem de acordo com a Eq. (2).
os erros de registro afinados avaliados estão listados na Tabela 1. O original deslocamentos \(\Delta q_{\text{rms}}\) variando de 3.01 para 7.09 mm são reduzidos após a ‘semelhança’ de inscrição para o intervalo de 0.45 para 1.71 mm de \(\Delta r_{\text{rms}}\) para a testada C3 planta. Os mesmos parâmetros para a CAM planta são \(1.90 \div 5.69\;{\text{mm}}\) para \(\Delta q_{\text{rms}}\) e \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) para \(\Delta r_{\text{rms}}\). Quando o \(\delta_{rms}\) é calculado em média para as séries de imagens C3 e CAM, é igual a cerca de 21% e 23%, respectivamente. Os valores dos parâmetros de fluorescência Y(NO), Fv/Fm e NPQ obtidos a partir de imagens de folhas de plantas de gelo sem registo são obtidos a partir de partes incompatíveis da folha e não podem ser tidos em conta (Ver ficheiro adicional 2).
Para o mapeamento adicional de registo B-spline, o erro de transformação é definido por dois componentes. O primeiro deles é o deslocamento pós-registro \(\Delta r_{i} = r_{i} P_{i}\) mostrado na Fig. 7a, com \(R_{i}\) avaliado em Eq. (3) como o centro \(\bar{p}\) da região \(A_{i}\).
onde \(I_{R} \left( p \right) \in \left\) denota a intensidade do controlo registado imagem do ponto ao pixel p, \(\left| {A_{i} } \right|\)—a indefinição área da região. O segundo componente de erro é definido pelo raio de desvio-padrão \(\rho_{i}\) de intensidade espalhada em torno de cada ponto de controlo \(R_{i}\), tal como descrito em Eq. (4).
onde \(\left\| \cdot \right\|\) denota a norma Euclidiana do vetor entre os pontos p e \(\bar{p}\) no plano de imagem. O desfocamento do ponto de controlo alinhado \(R_{i}\) parece dever-se ao facto de o registo não linear usar interpolação bicúbica na grelha de resolução finita G. este efeito foi medido experimentalmente através da realização de uma dada transformação B-curva na imagem construída a partir de pontos de controlo brancos sobre um fundo preto. A tabela 2 inclui as magnitudes \(\Delta q_{i}\) de n = 9 exemplos de vectores de campo de deslocamento apresentados na figura. 5b. As magnitudes \(\Delta r_{I}\) dos erros de mapeamento do vector após o registo da linha são medidas entre os pontos de controlo fixos desejados \(P_{i}\) e os centroids dos pontos registados \(R_{i}\) avaliados na região \(A_{i}\). Todos os valores testados \(\Delta r_{I}\) estão abaixo da resolução dos pixels igual a \(50\;\upmu{\text{m}}}\) e podem ser negligenciados—arredondados para 0. Isso significa um posicionamento preciso dos pontos de controle pela transformada de linha. O desvio-padrão \(\rho_{I}\) da região de borrão mostrada no quadro 2 após a duplicação pode ser uma medida do borrão do ponto de controlo. Depois, varia aproximadamente de \(24\; {\text{to}}}\; 63\;\upmu{\text{m}}}\) Qual é o equivalente a um borrão de um pixel. Assim, esta transformada permite restaurar localmente a forma adequada de Y (NO) mudanças em uma imagem de fluorescência.
explicação do erro no registo de imagens B-spline das imagens PAM. a o desfasamento do mapeamento da localização do ponto de controlo durante o registo, B distribuição da intensidade da imagem do ponto de controlo registado em linha, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—ponto de controle na imagem fixa \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—o equivalente a ponto de controle \(P_{i}\) em imagem em movimento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapeamento do ponto de controle \(P_{i}\) após o registro, \(R_{i} P_{eu} =\Delta r_{i}\)—deslocamento medida de erro de mapeamento de controle de ponto \(P_{i}\), \(A_{i}\)—turva região em torno de \(R_{i}\), correspondente ao ponto de controle \(P_{i}\), \(\rho_{i}\)—o desvio padrão raio de \(R_{i}\) borrão
The measurement of stress propagation
The data analysis applies a special editor tool for manipulating a stack of PAM images after their registration. A função principal do editor permite desenhar duas secções da linha de aquisição de dados \(L_{1} \; {\text{and}}}\; L_{2}\) de tamanho igual(Fig. 8), que pode ser observado e disponível em qualquer imagem da pilha. No experimento considerado, a primeira linha \(L_{1}\) começa no local da inoculação \(s_{1}\), onde o Fator de estresse é aplicado ao tecido da folha no momento t, e deve ser definido aproximadamente na direção da expansão do estresse. A segunda linha \(L_{2}\) é colocada ao longo do midrib, onde a influência de stress observada no tempo foi sempre limitada e os parâmetros de fluorescência apresentam alterações mínimas. As linhas devem encaixar-se inteiramente no contexto da imagem.
as regiões de medição em Y (NO) imagens da planta de gelo comum saem após o alinhamento do computador. Os pontos de medição indicam: (1) mesophyll no local de inoculação, (2) mesophyll sem lesão, (3) midrib perto do local de inoculação. A linha de medição (L1) é orientada na direção da propagação de tensões dentro do mesophyll e a linha (L2) está localizada ao longo do midrib. As linhas começaram nos pontos (S1) e (S2), respectivamente
uma opção adicional de medição em termos de pontos é possível quando três pequenas regiões circulares diferentes do raio de 10 pixels são colocadas interactivamente no campo de visão(Fig. 8). Devem pertencer às regiões de folhas com diferentes parâmetros de fluorescência ao longo do tempo. Todos os valores de pixels registados são calculados em média dentro destas regiões.