Escondidos à vista de todos–muito abundantes e diversas planctônicas de água doce Chloroflexi

Abundância e diversidade do filo Chloroflexi em ambientes de água doce

a partir de rRNA 16S de leitura abundâncias de 117 metagenomes de lagos, reservatórios e rios, representantes do filo Chloroflexi composta de até 7% dos procariontes comunidade no epilimnion (Fig. 1a, b), no entanto, com grandes flutuações. Similar a observações anteriores , a linhagem CL500-11 dominou as amostras de hipolimnião (atingindo pelo menos 16% em todas, exceto uma amostra, e quase 27% em uma amostra do Lago Biwa) (Fig. 1c), além de um grupo menos conhecido referido como o aglomerado TK10. A maioria das sequências de 16S rRNA relacionadas com TK10 na base de dados SILVA provêm do solo, pele humana ou amostras metagenômicas desconhecidas, enquanto apenas quatro (1,5%) são de águas frescas (arquivo adicional 1: Figura S1A).

surpreendentemente, as amostras de epilimnion foram dominadas por sequências filiadas ao “SL56 marine group” (até ca. 5% da comunidade procariótica total). Sequências relacionadas com SL56 de SILVA foram recuperadas de um lago de água doce e dos conjuntos de dados da série Global Oceânica (GOS) . No entanto, a amostra de GOS a partir da qual foram descritos é na verdade um conjunto de dados de água doce, Lago Gatun (Panamá). É bastante evidente pelos nossos resultados (Fig. 1; arquivo adicional 1: Figura S2) que este aglomerado é consistentemente encontrado apenas em lagos, reservatórios e rios, mas não no habitat marinho, sugerindo que tem sido incorretamente referido como um “grupo marinho”. Outro grupo de sequências, referido como JG30-KF-CM66, descrito a partir de diversos ambientes (pilha de resíduos de mineração de urânio, solo, água doce, coluna de Água Marinha e sedimentos), foi encontrado para ser preferencialmente distribuído em rios (particularmente o Rio Amazonas) do que Lagos (Fig. 1a, b), embora em abundância muito baixa (máximo 1% do total de procariontes). Abundâncias semelhantes foram encontradas no Mar Cáspio Salobro (profundidades de 40 m e 150 m) (ficheiro adicional 1: Figura S2).No entanto, não encontramos suporte para a presença do aglomerado SAR202 ou do seu clado irmão de água doce CL500-9 em todos os conjuntos de dados metagenómicos de água doce examinados. Em habitats marinhos e salobros, SAR202 são quase exclusivamente encontrados nas camadas aphóticas escuras, onde representam até 30% da comunidade procariótica . Se existem clados relacionados com SAR202 em habitats de água doce, eles certamente não são muito abundantes ou talvez não se originaram da coluna de água no relatório original (arquivo adicional 1: Figura S1). Em geral, embora a abundância relativa de Cloroflexos na epilimnia de água doce seja muito menor do que nas águas mais profundas, eles são o lar de uma rica e ampla coleção de novos grupos.

Com essas observações, é também evidente que, em ambientes aquáticos aqui examinados (água doce, salobra e marinha), a diversidade de Chloroflexi representantes é substancialmente diferente, com os ambientes de água doce abrigando uma filogeneticamente mais diversa variedade de grupos que salobras ou marinhas. Além disso, há evidências claras da presença de apenas grupos de água doce (e.g., SL56) e apenas grupos marinhos e salobros (SAR202), reiterando que a salinidade é uma barreira para as transições de habitats microbianos entre ecossistemas de água doce e marinhos . Não é de forma alguma uma barreira intransponível como transições relativamente recentes de água doce para Mar (por exemplo, a água doce ” Ca. Methylopumilus spp.”and marine OM43 ) and in reverse (marine Pelagibacter and freshwater LD12) have both been proposed. No entanto, é provável que os grupos encontrados em ambientes salobros talvez possam ser simplesmente melhores “preparados” para incursões mais bem sucedidas. Encontramos exemplos de grupos que estão presentes em metagenomas de água doce e salobra (JG30-KF-CM66 e CL500-11).

O maior de água doce Chloroflexi representantes

Automatizado binning de Chloroflexi relacionados contigs de módulos (assemblies) de cada 57 conjuntos de dados pertencentes a 14 diferentes ambientes (28 de lagos/reservatórios, 26 de rios, e 3 salobra conjuntos de dados), resultou na segregação de 102 Gams (metagenome-montado genomas) no total (de arquivo Adicionais 2: Tabela S1). A análise filogenómica de MAGs com 30% ou mais de Completude (n = 53) mostra que uma diversidade notavelmente elevada de MAGs foi recuperada de praticamente todas as classes bem conhecidas de Cloroflexos (Fig. 2). Trinta e cinco MAGs constituíam três novas linhagens de nível de classe sem representantes cultos disponíveis (SL56, TK10 e JG30-KF-CM66).

Enquanto hibridização in situ por fluorescência seguido por catalisada repórter deposição (CARTÃO-PEIXE) detectado um alto número de CL500-11 de células em Lago de Zurique epilimnion durante parcial mixis no inverno, o pico de abundância níveis sempre foram encontradas em zonas mais profundas, tanto do Lago de Zurique (11% de todos os procariotas; Fig. 3a) e Lago Biwa (até 14%; Fig. 3d). CL500-11 abundância correlacionada negativamente com a concentração de temperatura e clorofila a (ficheiro adicional 1: Figura S3). Em amostras do reservatório de Řimov, no entanto, CL500-11 estava abaixo do limite de detecção (< 0,18%), sugerindo que este habitat relativamente raso (profundidade máxima de 43 m) não representa um nicho preferido para este grupo de bactérias (ficheiro adicional 1: Figura S4). Células CL500-11 foram visualizadas previamente pelo CARD-FISH e mostraram ser grandes, células curvas . Formas e tamanhos semelhantes foram observados em amostras de peixes do Lago Zurique com comprimentos médios de 0,92 µm (intervalo 0,4–1,6 µm; n = 277) e larguras de 0,28 µm (intervalo 0,19–0,39 µm). Analisando os volumes celulares (mediana 0.06 µm3) e biomassa para este aglomerado em comparação com todos os procariotas (Fig. 3c) sugere uma contribuição extremamente elevada da população CL500-11 para a biomassa microbiana total. A sua relação biomassa / abundância é de quase 2, ou seja, com uma abundância de 10%, representam quase 20% da biomassa procariótica total, o que indica uma adaptação notável ao hipolimnion profundo relativamente oligotrófico, atingindo populações elevadas, mesmo com as suas grandes dimensões celulares.

recuperamos 11 MAGs (10 águas frescas, 1 salobra) para CL500-11 no total. Todas as quatro MAGs do Lago Biwa de diferentes meses formam uma única espécie. No entanto, as duas espécies do Lago de Zurique, parecem coexistir durante todo o ano (Março, Maio e novembro), com uma espécie de ramificação em conjunto com o descrito anteriormente MAG do Lago Michigan (CL500-11-LM) e a outras espécies de ter perto de representantes também no salobra Cáspio (> 95% ANI) e semelhantes metagenomic fragmento de padrões de recrutamento (Figs. 2 e 4c). Propomos o candidato gênero Profundisolitarius (Pro.divertido.di.então.li.ta’ri.nós. L. adj. profundus profunda; L. adj. solitarius sozinho; N. L. masc. n. Profundisolitarius a sole recluse from the deep) within Candidatus Profundisolitariaceae fam. novembro. para o cluster CL500-11 (classe Anaerolinea).

por outro lado, o grupo SL56 é a linhagem dominante no reservatório Řimov (máximo 1.1%), tanto por 16S rRNA e análises de peixe com cartão (figos. 1 e 3). Abundâncias máximas eram quase sempre encontradas em cerca de 5-20 m a temperaturas de ca. 15 ° C, O que sugere que este grupo é essencialmente epilimnético (ficheiro adicional 1: figuras S3 e S4). Esta região da coluna de água (termoclina), além de ter um gradiente de temperatura, também tem uma intensidade de luz significativamente menor em comparação com as camadas de superfície. A abundância máxima do cyanobacterium Planctothrix rubescens, adaptado à luz baixa, a cerca de 13 m de profundidade, nos perfis de Verão estratificados do Lago Zurique coincidem com a abundância máxima do SL56 (ficheiro adicional 1: Figura S3). As células SL56 são em forma de vara e alongadas (comprimento médio = 0,68 ± 0,25 µm; largura média = 0,35 ± 0,09 µm; n = 6; Fig. 3e). Tanto quanto sabemos, este é o primeiro relatório de um grupo de Cloroflexos específico de água doce que parece prosperar no epilimnion.

um total de 14 MAGs foram recuperados para o cluster SL56 (1 contendo 16S rRNA) e formam uma linhagem de classe, consideravelmente divergente de todas as Cloroflexas conhecidas (Fig. 2). Seu único parente é um único MAG (Cloroflexi CSP1-4) descrito a partir de sedimentos aquíferos . O clado rRNA 16S ao qual o CSP1-4 supostamente afiliados é Gitt-GS-136 , e a maioria das sequências deste clado se originam de sedimentos de solo ou rio (informações da taxonomia de SILVA). No entanto, não conseguimos detectar qualquer sequência rRNA 16S (parcial ou completa) na sequência genoma disponível do CSP1-4. O clado mais próximo (na taxonomia rRNA 16S) de Gitt-GS-136 e SL56 é KD4-96, cujas sequências foram obtidas dos mesmos habitats (ver ficheiro adicional 1: Figura S1B). Além disso, todas as sequências rRNA 16S conhecidas do grupo SL56 se originam apenas de águas doces (Lago Gatun, Lago Zurique, etc.). Juntos, parece que os parentes filogenéticos mais próximos da linhagem SL56 de água doce habitam o solo ou os habitats de sedimentos.

SL56 MAGs foram reconstruídos a partir de locais geograficamente distantes (Europa, América do Norte e América do Sul, Fig. 2), e pelo menos nove espécies diferentes poderiam ser detectadas (ANI, Fig. 1). Não foram obtidos MAGs de amostras do Lago Biwa, mas três sequências rRNA 16S foram recuperadas em contigs não geminados. Os MAGs reconstruídos são globalmente distribuídos ao longo de conjuntos de dados de água doce a partir do epilimnion (nenhum detectado no hipolimnion profundo) (Fig. 4 e Ficheiro adicional 1: Figura S6). Nenhum SL56 MAGs foi reconstruído do Mar Cáspio, e nenhum dos genomas recuperados recrutados a partir de metagenomas salobros. Propomos o género candidato Limnocilindrus (Lim.no. CY.lin’Drus. Gr. fem. n. limne a lake; L. masc. n. cylindrus a cylinder; N. L. masc. N. Limnocilindrus, um cilindro de um lago) no interior de Limnocilindraceae fam. novembro., Limnocilindrales ord.nov., e Limnocilindria classis. novembro. para o aglomerado de Cloroflexi SL56.

tk10 16S sequências rRNA foram encontradas nas mais altas abundâncias em amostras de hypolimnion do Lago Biwa (máximo ca. 2%) (Fig. 1a, c). As células eram ovóides com um comprimento estimado de 1, 08 ± 0, 1 µm e largura de 0, 84 ± 0, 09 µm (n = 12; Fig. 3e). Um conjunto coerente de nove MAGs (três contendo 16S rRNA ficheiro adicional 1: Figura S1) de locais geograficamente distantes (Europa, Ásia e América do Norte) foi recuperado. Estes organismos notavelmente cosmopolitas que prosperam em camadas mais profundas do lago não são muito diversos (valores ANI > 95%). Esta aparente baixa diversidade pode ser uma consequência de um nicho muito especializado ou o que é mais provável, um resultado de uma transição relativamente recente para a água doce, semelhante a “Ca. Fontibacter ” (LD12 Alphaproteobacteria) . No 16S representantes da rRNA foram detectados com confiança em metagenomas marinhos ou salobros, embora algumas sequências de rRNA 16S da base de dados SILVA tenham sido obtidas a partir de sedimentos marinhos e coluna de água (ficheiro adicional 1: Figura S1). Parentes mais próximos do 16S rRNA parecem ser do solo ou de amostras de sedimentos sugerindo que estes podem ser o seu habitat original. Curiosamente, o aglomerado TK10 é também ramificação profunda, apenas após SL56 e CSP1-4 na árvore filogenética de Cloroflexi em geral, e todos os outros representantes do Cloroflexi (MAGs ou genomas isolados) parecem ser descendentes de um ramo distinto a ambos. Sugerimos o género candidato Umbricyclops (Um.bri.cy ” clops. L. fem. N. umbra shadow; L. masc. n. Ciclope (de Gr. Redondo eye; Cyclops) a cyclops; N. L. masc. n. Umbricyclops a round-eye living in the shade) within Umbricyclopaceae fam. novembro., Umbricyclopales ord.nov., e Umbricyclopia classis nov. para este grupo de organismos.

os resultados dos peixes de cartão mostram que as células JG30-KF-CM66 são esféricas, com um diâmetro estimado de 0, 56 µm (± 0, 15 µm; n = 8; Fig. 3e); no entanto, foram observadas proporções muito baixas (< 0,28%) para o JG30-KF-CM66 no Lago Zurique e os perfis de profundidade do reservatório de Řimov (ficheiro adicional 1: figuras S3 e S4). Obtivemos 12 MAGs, principalmente a partir da coluna de águas profundas( oito salobras, quatro de água doce), uma com uma seqüência quase completa 16S, que formou uma nova linhagem de nível de classe na análise filogenômica (Fig. 1). Os parentes mais próximos destes MAGs são marine SAR202 e Dehaloccoidea (Fig. 1 e Ficheiro adicional 1: Figura S1). Dentro deste aglomerado, grupos distintos de Magas salobras e de água doce podem ser distinguidos. Sugerimos o género candidato Bathosphaera (Ba.to.sphae’Ra. G. adj. bathos deep; L. fem. n. sphaera a sphere; N. L. fem. N. Bathosphaera a coccoid bacteria living in the deep) within Bathosphaeraceae fam. novembro., Bathosphaerales ord.nov., e Bathosphaeria classis. novembro. para o aglomerado de Cloroflexi JG30-KF-CM66.

também recuperamos MAGs nas classes Cloroflexia (quatro MAGs) e Caldilineae (dois MAGs) (Fig. 1). Cloroflexia MAGs foram relacionados com Mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 na sub-ordem Cloroflexineae (um MAG) e três outros MAGs a Kouleothrix aurantiaca na Kouleotrichaceae fam. novembro. formando uma nova sub-ordem para a qual propomos o nome de sub-ordem Kouleothrichniae. novembro. Nenhum destes Carregadores mostra qualquer recrutamento significativo de fragmentos além do seu local de origem. Um adicional de 14 MAGs do Cáspio afiliado ao aglomerado de SAR202 que não será discutido mais aqui como eles já foram descritos .

Contribuição de água doce Chloroflexi no funcionamento dos ecossistemas

Metabólica insights sobre o reconstruída Chloroflexi Gams (integralidade ≥ 30%) sugerem um principalmente heterotróficos estilo de vida que, em alguns grupos é impulsionado pela luz orientado a geração de energia através de rhodopsins (CL500-11, Chloroflexales, SL56, e TK10) ou aeróbico anoxygenic phototrophy (Chloroflexales). Os MAGs de cada aglomerado contêm genes necessários para o metabolismo central dos hidratos de carbono, incluindo glicólise, gluconeogénese e ciclo do ácido tricarboxílico. Genes-chave para a redução do sulfato assimilatório (3′-fosfoadenosina 5′-fosfossulfato (PAPS) sintase e adeniltransferase de sulfato) estavam ausentes na maioria dos MAGs sugerindo a utilização de compostos de enxofre exógenos reduzidos . Os genes de desnitrificação (nitrate reductase/nitrite oxidoredutase alfa e subunidades beta e nitrite reductase) foram encontrados em Tk10 MAGs, mas as enzimas subsequentes responsáveis pela produção de azoto molecular foram ausentes.

em ambientes aquáticos, Taumarchaeota e cianobactérias são a principal fonte de cobalamina e seus precursores corrinóides para a grande comunidade de auxotróficos ou aqueles poucos capazes de salvar . A síntese de novo da cobalamina tem um alto custo metabólico, e a hipótese da Rainha Negra foi apresentada como uma explicação para as razões pelas quais apenas alguns membros da comunidade empreendem a sua produção . Nenhum dos Cloroflexos reconstruídos codificam genes necessários para a biossíntese do anel da Corrina a partir do zero, e cobalamina de alta afinidade (BtuBFCD) ou outros transportadores suspeitos de corrinóides (DET1174-DET1176) também estavam faltando, o que pode ser uma consequência da incompletude do genoma ou do uso de um transportador não descrito. No entanto, nem todos estes organismos parecem ser auxotróficos como os MAGs do cluster JG30-KF-CM66 codificam genes para a cobinamida para a via de recuperação de cobalamina que utiliza os corrinóides importados juntamente com intermediários da via de biossíntese da riboflavina para sintetizar a cobalamina . A ZH-cloro-G3 MAG contém uma solução de cobalamina quase completa (apenas CobC em falta) e a via de biossíntese da riboflavina (ficheiro adicional 3: Tabela S2).Genes de conjunto flagelar estavam presentes em vários MAGs de CL500-11 e tk10 clusters (Fig. 1 e Ficheiro adicional 3: Quadro S2). No entanto, os componentes do anel L E P que ancoram flagela à membrana externa estavam faltando em todos os MAGs flagelados e genomas de referência Cloroflexi (por exemplo , Termomicrobium, Sphaerobacter ). Além disso, MAGs e genomas de referência Cloroflexi não codificaram genes para a biossíntese LPS e nenhum sistema de SEC e Tat foram detectados (sistemas de secção Tipo I–IV ancorados na membrana externa estão ausentes) (ficheiro adicional 3: Tabela S2). Em conjunto, a genómica comparativa dos genomas Cloroflexos disponíveis reforça inferências que, enquanto os micrografos de elétrons sugerem duas camadas densas de elétrons na maioria dos membros deste filo, o Cloroflexi provavelmente possui uma única membrana lipídica (monoderma) ao invés de duas (diderms) .

sequências semelhantes a Rodopsinas foram reconhecidas em 18 MAGs deste estudo por representantes de CL500-11, Cloroflexia, SL56 e TK10 que são filogeneticamente mais próximas de xanthorhodopsinas (ficheiro adicional 1: Figura S8A e B), e são sintonizados para absorver luz verde semelhante a outras rodopsinas de água doce e Costeira (ficheiro adicional 1: Figura S8C). Vários MAGs codificam genes para biossíntese carotenóide permitindo a possibilidade de uma antena carotenóide que é a marca de xantorhodopsinas . Dos resíduos envolvidos com a ligação da salinixantina (o carotenóide predominante do Salinibacter ruber), detectámos um número surpreendentemente elevado de conservantes (10 idêntico em 12 em pelo menos uma sequência de rodopsina) (ficheiro adicional 1: Figura S8D), sugerindo que uma antena carotenóide pode estar ligada, fazendo pelo menos algumas destas sequências bonafide xanthorhodopsinas.Mesmo os representantes dos CL500-11 e TK10 que são encontrados principalmente no hipolimnion durante a estratificação são capazes de fototrofia; no entanto, eles podem potencialmente acessar a zona fótica durante o inverno e início da primavera mixis. Além da fotoheterotrofia baseada em rodopsina, também recuperamos MAGs da classe Cloroflexia codificando genes para as proteínas L E M (pufL e pufM), bacteriochlorophyll, e biossíntese carotenóide. As sequências genéticas pufM agrupam-se juntamente com outras sequências pufM relacionadas com o Cloroflexi (ficheiro adicional 1: Figura S9). No entanto, nenhuma evidência para fixação de carbono, através da Via 3-hidroxipropionato ou do ciclo Calvin–Benson foi encontrada em qualquer sistema de fotos com MAG que pode ser uma consequência da incompletude MAG. Pode também ser que estes sejam fototróficos anoxigênicos aeróbicos que não fixam carbono, por exemplo, Gemmatimonadetes de água doce e Acidobactérias (ambos aeróbicos) .

história Evolutiva dos pelágicos Chloroflexi

é evidente a partir dos phylogenomic análises que o conjunto de representantes do filo Chloroflexi recuperado neste trabalho, juntamente com a existência de sequências do genoma de isolados e MAGs, oferece apenas um esboço parcial do complexo história evolutiva do filo em geral. Por exemplo, os ramos mais divergentes “Ca. Limnocilindria “(cluster SL56) e ” Ca. Umbricyclopia “(aglomerado TK10) não tem praticamente nenhum Parente Próximo além de um sedimento de aquífero MAG (relacionado com ” Ca. Limnocilindria”). No entanto, Clones rRNA relacionados 16S foram recuperados do solo / sedimentos para ambos os grupos, sugerindo transições para um estilo de vida pelágico (arquivo adicional 1: Figura S1B).

Factoring the absence of related marine 16S rRNA sequences for these groups, in addition to their undetectability in marine metagenomic datasets also suggests an ancestry from soil/sediment rather than the saline environment. Embora a possibilidade de uma origem marinha não possa ser formalmente excluída, a direccionalidade de uma transição do solo/sedimento para colunas de água doce parece mais provável. Além disso, dado que ” Ca. Limnocilindria ” e ” Ca. Umbricyclopia ” diverge antes da divergência das classes Dehalococcoidea e marine SAR202 (classe “Ca. Monstramaria”), que é o único Cloroflexo marinho ecologicamente relevante conhecido até agora (o primeiro em sedimentos marinhos e o segundo na coluna de águas profundas do oceano), é provável que o Cloroflexi ancestral tenha se originado em um habitat Solo/sedimento. O sucesso do sar202 marinho nos oceanos profundos é notável; é o grupo de Cloroflexos mais amplamente distribuído, talvez numericamente mais abundante no planeta. No entanto, algumas sequências rRNA 16S de seus parentes mais próximos, Dehaloccoidea, também foram recuperados a partir de sedimentos de água doce, embora a grande maioria pareça ser de sedimentos marinhos profundos (ambos habitats anóxicos).