ensaios simplificados de ChIP-exo

anticorpos

IgG de coelho (Sigma) conjugados com Dynabeads foi utilizado contra estirpes marcadas na torneira em que a etiqueta contendo a proteína A era o alvo. Millipore 07-729 anticorpo foi usado contra K562 amostras visando CTCF.

purificação Tn5

uma construção personalizada de Tn5 E54K E110K P242A L372P14 num vector pET-45b( + ) foi ordenada (GenScript) para expressar Tn5 hiperactivo com um His6-tag N-terminal. O plasmídeo está disponível em Addgene (ID Addgene: 112112). As células de E. coli(Biolabs de Nova Inglaterra) competentes em BL21 (DE3) foram transformadas e uma única colónia foi cultivada a 37 °C para uma OD600 de 0,4 em 500 ml de LB + 50 µg/ml de ampicilina + 30 µg/ml de cloranfenicol. As células foram transferidas para uma incubadora a 25 °C e induzidas com 0,5 mM de isopropil-β-D-galactopiranósido durante 4 H. as células foram recolhidas por centrifugação, lavadas uma vez com tampão ST, e o sedimento da célula foi congelado em azoto líquido.

Tn5 foi purificado tal como descrito anteriormente 10, com poucas modificações. Resumidamente, as células foram em suspensão em 10 volumes (ml/g) de TEGX100 Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, com 0,1% de Triton-X 100) contendo CPI e 100 µM phenylmethylsulfonyl flúor e lisadas pela incubação com lisozima (Sigma; 1 mg / 1 g de pellet de células) em temperatura ambiente por 30 min. O lisato foi centrifugado a 20 000 × g durante 20 minutos a 4 ° C, e o sobrenadante foi precipitado com 0,25% de polietilenoimina (Sigma) e centrifugado a 10 000 × g durante 15 minutos. O sobrenadante foi então precipitado com sulfato de amónio de saturação de 47% (0.28 g / ml) durante uma incubação de 30 minutos e, em seguida, centrifugado a 20 000 × g durante 15 minutos.O sedimento foi então ressuspendido em 50 ml de tampão de afinidade com níquel (fosfato de potássio de 50 mM, pH 7, 4, 50 mM KCl, 20% glicerol) e carregado numa coluna HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) a 1, 5 ml/min, equilibrado com o mesmo tampão. A coluna foi lavada sequencialmente com tampão de lavagem I (fosfato de potássio de 50 mM, pH 7.4, 1 m KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol), Tampão de lavagem II (fosfato de potássio de 50 mM, pH 7.4, 500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol), e depois o Tn5 foi eluído com tampão de eluição de afinidade com níquel (fosfato de potássio de 50 mM, pH 7, 4, 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glicerol) a 2 ml/min. O eluato foi diluído para 300 mM de KCl, com Tampão de Diluição (50 mM de fosfato de potássio, pH 7.4, 20% de glicerol), e o volume final ajustado para 50 ml com TEGX300 Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, com 0,1% de Triton-X 100).Em seguida, a amostra foi carregada numa coluna HP de heparina HiTrap (GE Healthcare; 1 ml) equilibrada com TEGX300 a 1 ml/min. Após lavagem com 5 volumes de tampão, foi executado um gradiente NaCl linear de 10 ml (300 mM a 1,2 M) para eluir. Tn5 eluído da coluna a aproximadamente 600 mM NaCl. As frações contendo os principais pico de eluição foram combinados (3,5 ml) e dialyzed durante a noite contra TEGX300 Tampão contendo 30% de glicerol, e, em seguida, armazenadas a -80 °C.

Levedura cromatina preparação

TOQUE marcados de cepas de Saccharomyces cerevisiae (Abrir Biosystems) foram cultivadas em 500 ml de levedura peptona glicose mídia para uma OD600 = 0,8 em 25 °C. As células foram cruzadas com formaldeído a uma concentração final de 1% durante 15 minutos à temperatura ambiente, e apagadas com uma concentração final de 125 mM de glicina durante 5 minutos. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas em 1 ml de tampão ST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 100 mM NaCl) a 4 °C e divididas em duas alíquotas. As células foram novamente embalsamadas, o sobrenadante foi removido e o sedimento ficou congelado.

a alíquota de cultura de 250 ml foi lisada em 750 µl de tampão DE Fa lise (50 mM Hepes-KOH, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% de sódio deoxycholate, e CPI) e 1 ml de volume de 0,5 mm de zircônia/sílica contas por esferas de bater em um Mini-Beadbeater-96 máquina (Biospec), por três ciclos de 3 min/5 min off ciclos (Amostras foram mantidas em gelo durante o ciclo). O lisato foi transferido para um novo tubo e microcentrifugado à velocidade máxima de 3 minutos a 4 °C para sedimentar a cromatina. O sobrenadante foi eliminado e o sedimento ressuspenso em 750 µl de tampão de Lise, suplementado com 0,1% de SDS e transferido para um tubo cónico de 15 ml de poliestireno. A amostra foi então sonicada num Bioruptor (Diagenode) durante 15 ciclos com intervalos de 30 s on/off para obter fragmentos de ADN de 100 a 500 bp de tamanho. Um doseamento ChIP-exo processou o equivalente a 50 ml de cultura celular (~6 × 108 células). Isto representa uma quantidade conveniente ao invés de uma quantidade mínima necessária.

K562 preparação de cromatina

células humanas de leucemia mielóide crónica (K562, ATCC) mantiveram-se entre 1 × 105 e 1 × 106 células/ml em meio DMEM, suplementadas com 10% de soro fetal bovino a 37 °C com 5% de CO2. As células foram lavadas com PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, e de 2,7 mM KCl), então cruzadas com formaldeído a uma concentração final de 1% por 10 min à temperatura ambiente, e temperada com uma concentração final de 125 mM de glicina por 5 min. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 1 ml de PBS para lavagem. As células foram aliquotadas para conter 100 milhões de células, centrifugadas, o sobrenadante foi removido, e o sedimento foi congelado.

uma alíquota de 100 milhões de células (para uso em múltiplos ChIPs) foi lisada em 500 µl (Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0, NaCl de 10 mM, 0.5% NP40 e inibidor da protease completo (IPC, Roche), por incubação no gelo durante 10 minutos. O lisado foi microcentrifuged a 2500 rpm por 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido, o sedimento em suspensão em 1 ml (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA, DE 0,32% SDS, e a CPI), e incubado em gelo por 10 min para lisar os núcleos. A amostra foi diluída com 600 µl de tampão de diluição de imunoprecipitação (Tampão de diluição IP: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 e CPI) até uma concentração final de (40 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS, e CPI), e sonicados com um Bioruptor (Diagenode) durante 10 ciclos com intervalos de 30 s on/off para obter fragmentos de ADN de 100 a 500 bp de tamanho.

Mouse tecido preparação

16 semanas de idade adultos do sexo masculino mouse cérebro, pulmão, fígado, rins e tecidos foram generosamente fornecidos pelo Dr. Yanming Wang Mouse tecidos foram processados em 100 mg e cromatina foi gerado como anteriormente described21 com pequenas modificações. Em suma, picaram-se 100 mg de tecido de rato em pedaços sobre gelo, fixados com 1% de formaldeído durante 10 minutos, e depois apagaram-se com uma concentração final de 125 mM de glicina durante 5 minutos. As células foram fiadas, lavadas com PBS, e depois ressuspendidas em 1 mL de tampão de lise das células frias de Farnham (Tris-HCl de 20 mM, pH 8, 0, 85 mM KCl, 0, 5% NP-40, Triton X-100 de 0, 5% e IPC). As células foram então incubadas em rototorque durante 20 minutos a 4 C. Os núcleos isolados foram isolados por desmonte e ressuspendidos em tampão de lise nuclear RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxicolato, 0,5% SDS e IPC). Os núcleos foram então sonicados com um Bioruptor (Diagenode) para 10 ciclos com intervalos de 30 s on/off para gerar DNA na gama de tamanho de 100-500 bp. O número de células hepáticas foi estimado como descrito anteriormente 22, utilizando um factor de conversão de 1 mg de peso húmido do tecido é igual a ~250 000 células.Imunoprecipitação de cromatina

imunoprecipitação de cromatina

uma cultura de 50 ml equivalente a levedura ou 10 milhões de células equivalentes a cromatina foi diluída para 200 µl com tampão de diluição IP e incubada durante a noite a 4 °C com o anticorpo adequado. Adicionou-se às amostras de levedura um volume de cama de 10 µl de IgG-Dynabeads.; e 3 µg de anticorpo anti-CTCF com um equivalente de 10 µl de proteína a Sefarose Mag (GE Healthcare) foi adicionada às amostras de K562.

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 foi realizado como descrito anteriormente 7, 8, 23. Em resumo, os seguintes passos enzimáticos foram realizados com cromatina imunoprecipitada ainda na resina com múltiplas lavagens de sal entre cada etapa: Polimento do fim da polimerase do ADN T4, cinase do polinucleótido T4, descolamento do fragmento a de Klenow, ligadura do adaptador Read_2 mediada pela ligase do ADN T4, enchimento da polimerase do phi29, cinase do segundo polinucleótido T4, digestão da exonuclease de lambda e digestão da exonuclease de RecJf. Após a ligação cruzada inversa e o tratamento com Proteinase K durante a noite, foram realizados os seguintes passos em solução: extensão de phi29 primer, segundo fragmento a de Klenow, ligação de Read_1 mediada pela ligase do ADN T4, e PCR.

ChIP-exo 3.0 e 3.1 (tagmentation-based version)

After immunoprecipitation, the following steps were carried out on the resin. Para montar a Transposase, o Tn5 foi incubado numa mistura de 10 × Transposase contendo os seguintes componentes e incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente: Tn5 de 12,5 µM, 50% de glicerol e Adaptador de 7, 5 µM (NexA2/ME comp). Ver tabela Complementar 1 para as sequências de oligonucleótidos utilizadas neste estudo.

o material do ChIP em resina foi lavado sequencialmente com tampão DE Fa lise, tampão NaCl (50 mM HEPES-KOH, pH 7, 5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% de sódio deoxycholate), LiCl (Buffer de 100 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM de LiCl, 1% NP-40, 1% de sódio deoxycholate), e 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

O tagmentation de reação (30 µl) contendo: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 10% de dimetilformamida, e 1 × Tagmentation Mistura do Passo 1 (concentração final: a 1,25 µM Tn5, 5% de glicerol, 750 nM adaptador) foi incubado por 30 min a 37 °C. a Seguir incubação, a resina foi lavada duas vezes com Guanidina-cloridrato de Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM de guanidina-hydrochloride, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% de sódio deoxycholate) por 5 min a 37 °C, em seguida, uma vez com LiCl Buffer e 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

O preenchimento de reação (30 µl) contendo: 10 U phi29 polimerase (NEB), 1 × phi29 reação de buffer (NEB), 2 × (200 µg/ml de BSA e 165 µM de dNTPs foi incubado por 20 min a 30 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C. O quinase de reação (30 µl) contendo: 10 U de T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA Ligase Buffer (NEB), e 2 × BSA foi incubado por 15 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O λ exonuclease digestão (100 µl) contendo: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reação de buffer (NEB), com 0,1% de Triton-X 100, e 5% de DMSO foi incubado por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O RecJf exonuclease digestão (100 µl), contendo: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0,1% De Triton-X 100, e 5% de DMSO foi incubado por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

DNA foi eluídas da resina, e o reverso de cross-linking e Proteinase K tratamento foram realizados (40 µl) contendo: a 30 µg de Proteinase K, 25 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, e de 0,5% SDS incubados por 16 h a 65 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e purificada com Agencourt AMPure magnéticos esferas (Beckman Coulter) seguir as instruções do fabricante e utilizar 1.8 × volume de AMPure de polpa adicionada ao volume de ADN (72 µl).A amostra foi eluída das esferas Ampuradas em 10 µl de água, e os seguintes passos enzimáticos foram realizados em solução.

ligaçãoadaptadora (versão 3.0): para a reacção de extensão de primer (volume total de reacção 20 µl); para a suspensão da amostra foi adicionado 1 × phi29 reação de buffer, 2 × BSA, 100 µM de dNTPs, e 0,5 µM ME sequência do oligonucleotide (total de 9 µl) e incubadas por 5 min a 95 °C, 10 min a 45 °C para permitir a oligo tempo de recozimento. A amostra foi deslocada para 30 ° C antes de adicionar 10 U de polimerase (1 µl) e incubar durante 20 minutos a 30 ° C; depois, durante 10 minutos a 65 ° C, inactivar, e deslocada para 37 °C.

para a reacção de degradação A (volume total de reacção 30 µl); para a extensão do primer de reação, foi adicionado 10 U Fragmento de Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (total de 10 µl) e incubadas por 30 min a 37 °C, por 20 min a 75 °C para inativar, e mudou para 25 °C. Para o segundo adaptador de ligadura de reação (total de volume de reação de 40 µl); a-tailing reação foi adicionado de 2.000 U de T4 DNA ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Rápida Ligadura de Buffer (NEB), 375 nM (adaptador de ExA1-58/13) e incubadas por 1 h a 25 °C.

Tala de ligadura (versão 3.1): para o adaptador de ligadura (40 µl); para a suspensão de DNA foi adicionado de 1.200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM (adaptador de ExA1-58/ExA1-SSL_N5) e incubadas por 1 h a 25 °C.

a versão 3.0 e 3.1: a ligadura de reação foi, então, purificado com AMPure contas e em suspensão em 15 µl de água. A amostra foi então amplificada através da PCR. Para amplificação PCR( volume total de reação 40 µl); ao DNA ressuspendido foi adicionado 2 U de Phusion de polimerase de Arranque A Quente (termo científico), 1 × Phusion tampão HF (termo científico), 200 µM dNTPs, 500 nM cada iniciador (P1.3 e NexA2-iNN) e ampliada para 18 ciclos (20 s a 98 °C desnaturar, 1 min a 52 °C recozimento, e 1 min a 72 °C extensão). Um quarto da reação foi amplificada por seis ciclos adicionais (24 no total) e a presença de bibliotecas foi determinada pela eletroforese em um gel de agarose de 2%.Selecção do tamanho

: os produtos de PCR de 200-500 bp foram purificados com gel a partir de um gel de agarose a 2% utilizando o Kit de extracção de Qiaquick Gel (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 e 4.1 (versões de ligação de ADN de cadeia simples)

após imunoprecipitação, foram realizados os seguintes passos na resina. O ChIP de material de resina foi lavada sequencialmente com FA Tampão de Lise, NaCl Buffer, LiCl Buffer, e 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O reparo de fim de reação (50 µl), contendo: 7.5 U de T4 DNA polimerase (NEB), 2,5 U de DNA Polimerase I (NEB), 25 U de T4 PNK, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, e 390 µM de dNTPs foi incubado por 30 min a 12 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 a 4 °C. O λ exonuclease digestão (100 µl), contendo: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reação de buffer, 0,1% de Triton-X 100, e 5% de DMSO foi incubado por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. O RecJf exonuclease digestão (100 µl), contendo: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0,1% De Triton-X 100, e 5% de DMSO swas incubadas por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

Primeiro adaptador de ligadura: ssDNA ligadura (versão 4.0, 40 µl): para adapterion ligadura 1200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, e 375 nM single-strand adaptador (ExA1-58-N5) foi incubada por 1 h a 25 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

Tala de ligadura (versão 4.1, 40 µl): 1200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, e 375 nM (adaptador de ExA2.1-N5/ExA2.1-20) foi incubada por 1 h a 25 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

versão 4.0 e 4.1: DNA foi eluídas da resina, e o reverso de cross-linking e Proteinase K tratamento foram realizados (40 µl) contendo: a 30 µg de Proteinase K, 25 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, e de 0,5% SDS incubados por 16 h a 65 °C.

o sobrenadante foi então transferido para um novo tubo e purificado com esferas magnéticas Ampuradas de Agencourt (Coulter Beckman) de acordo com as instruções do fabricante (1,8 × volume). A amostra foi eluída das esferas Ampuradas em 20 µl de água, e os seguintes passos enzimáticos foram realizados em solução.

Segundo adaptador de ligadura: ssDNA ligadura (versão 4.0, o total de volume de reação de 40 µl): para a suspensão de DNA foi adicionado 1200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM (adaptador de ExA2.1-N5/ExA2.1-20) e foi incubada por 1 h a 25 °C.

Tala adaptador de ligadura (versão 4.1, o total de volume de reação de 40 µl): para a suspensão de DNA foi adicionado 1200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM (adaptador de ExA1-58/ExA1-SSL_N5) e foi incubada por 1 h a 25 °C.

versão 4.0 e 4.1: a ligadura de reação foi, então, purificado com AMPure esferas (1.8 × volume) e em suspensão em 15 µl de água. A amostra foi então amplificada através da PCR. Para amplificação da PCR (volume total de reacção 40 µl); para a suspensão de DNA foi adicionado 2 U Phusion Quente Iniciar polimerase (Thermo scientific), 1 × Phusion Buffer de HF (Thermo scientific), 200 µM de dNTPs, 500 nM de cada primer (P1.3 e NexA2-iNN) e ampliada para 18 ciclos (20 s a 98 °C desnaturar, 1 min a 52 °C recozimento, 1 min a 72 °C extensão). Um quarto da reação foi amplificada por seis ciclos adicionais (24 no total) e a presença de bibliotecas foi determinada pela eletroforese em um gel de agarose de 2%. Selecção do tamanho: 200 a 500 BP os produtos PCR foram purificados em gel a partir de um gel de agarose a 2% utilizando o Kit de extracção de Qiaquick Gel (Qiagen).

Nota: ChIP-exo 4.0 / 4.1 incorporou um adaptador de Read_2 universal, com o código de barras adicionado mais tarde durante a PCR com iniciadores longos. Sempre que os iniciadores de PCR longos eram usados em uma construção de biblioteca que envolvia a digestão da lambda exonuclease, as bibliotecas sofriam de dimers de baixo rendimento e de alto adaptador. Agora só usamos adaptadores de comprimento total e iniciadores de PCR de comprimento mínimo.

Exo com ChIP 5.0

após imunoprecipitação, foram realizados os seguintes passos na resina. O ChIP de material de resina foi lavada sequencialmente com FA Tampão de Lise, NaCl Buffer, LiCl Buffer, e 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. Para o rejeito de reação (50 µl), contendo: 15 U Fragmento de Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, e 100 µM dATP foi incubado por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O primeiro adaptador de ligadura e quinase reações (45 µl) contém: 1200 U de T4 DNA ligase, 10 U de T4 PNK, 1 × NEBNext Rápida Ligadura de Buffer, e 375 nM (adaptador de ExA2_iNN / ExA2B) foi incubada por 1 h a 25 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O preenchimento de reação (40 µl) contendo: 10 U phi29 polimerase, 1 × phi29 reação de buffer, 2 × BSA, e 180 µM de dNTPs foi incubado por 20 min a 30 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C. O λ exonuclease digestão (50 µl) contendo: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reação de buffer, 0,1% de Triton-X 100, e 5% de DMSO foi incubado por 30 min a 37 °C; em seguida, lavadas com 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, a 4 °C.

DNA foi eluídas da resina, e o reverso de cross-linking e Proteinase K tratamento foram realizados (40 µl) contendo: 30 µg de Proteinase K, 25 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, e de 0,5% SDS incubados por 16 h a 65 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e purificada com Agencourt AMPure magnéticos esferas (Beckman Coulter) seguir as instruções do fabricante (1.8 × volume).A amostra foi eluída das esferas Ampuradas em 20 µl de água, e os seguintes passos enzimáticos foram realizados em solução. Para a ligação do segundo adaptador (volume total de reacção 40 µl): para a suspensão de DNA foi adicionado 1200 U de T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, 375 nM (adaptador de ExA1-58/ExA1-SSL_N5) e foi incubada por 1 h a 25 °C. A ligadura reação foi, então, purificado com AMPure esferas (1.8 × volume) e em suspensão em 15 µl de água.

a amostra foi então amplificada através da PCR. Para a amplificação da PCR( volume total de reacção 40 µl); ao ADN ressuspenso foi adicionada uma polimerase de arranque a quente com Phusão de 2 U (termo científico), um tampão HF de Phusão (termo científico), 200 µM dNTPs, 500 nM cada iniciador (P1.3 e P2.1) e amplificados durante 18 ciclos (20 s a 98 °C, 1 min a 52 °C de recozimento, 1 min a 72 °C de extensão). Um quarto da reação foi amplificada por seis ciclos adicionais (24 no total) e a presença de bibliotecas foi determinada pela eletroforese em um gel de agarose de 2%. Selecção do tamanho: 200 a 500 BP os produtos PCR foram purificados em gel a partir de um gel de agarose a 2% utilizando o Kit de extracção de Qiaquick Gel (Qiagen).

Nota: descobrimos que o uso de um método diferente da purificação do gel nesta fase leva a um nível inaceitavelmente elevado de dimers Adaptadores na amostra final. A purificação do Gel pode efetivamente separar o dímero (fragmento de 150 bp) e fragmentos menores da Biblioteca ChIP-exo (fragmento de 200 bp = Adaptadores BP 150 + inserção de 50 bp).

a sequenciação de ADN

a sequenciação de ADN de alta capacidade foi realizada com um NextSeq 500 em modo emparelhado, produzindo 2 × 40 leituras bp. As leituras de sequência foram posteriormente alinhadas com os genomas de levedura (sacCer3) e humana (hg19) usando BWA-mem (v0.7.9 a)24. As leituras alinhadas foram filtradas para remover alinhamentos não-únicos e duplicados PCR. Duplicados PCR foram definidos como sequências de leitura possuindo sequências de leitura idênticas de Read_1 e Read_2.

disponibilidade de dados

todos os ficheiros de sequenciação e ficheiros de pico deste estudo estão disponíveis na NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sob os números de adesão GSE110681 e GSE114606. Os arquivos de coordenadas, parâmetros de script e código personalizado usados para gerar as figuras deste artigo podem ser baixados a partir de: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

todos os outros dados estão disponíveis junto dos autores mediante pedido razoável.