neste vídeo irá observar como efectuar o ensaio de libertação de crómio e determinar o potencial citotóxico das células efectoras.
as células imunitárias são responsáveis pela identificação e remoção de células potencialmente prejudiciais, como o cancro ou as células infectadas pelo vírus, do organismo, que é parte integrante da resposta imunitária. Várias células imunitárias, como as células T e NK, possuem uma propriedade conhecida como potencial citotóxico, que é a capacidade de identificar células-alvo e segregar proteínas que induzem degradação proteica, lise e morte dessas células-alvo. A quantificação do potencial citotóxico é fundamental para medir a activação e a potência das células imunitárias, sendo o ensaio de libertação de crómio frequentemente utilizado para este efeito.
este método permite aos utilizadores comparar a citoxicidade induzida por tipos específicos de células imunitárias em diferentes condições, o que é valioso para o estudo da imunoterapia cancerígena e das doenças relacionadas com a imunidade. Para começar, as células-alvo, como as células cancerígenas, são incubadas com um isótopo radioactivo, o crómio 51, que é absorvido pelas células. Em seguida, estas células marcadas por rádio são co-cultivadas com as células imunitárias isoladas de interesse, também chamadas de células efetoras, em um fundo redondo, placa de 96 poços para facilitar a interação entre os dois tipos de células.
a configuração global do ensaio envolve a incubação de um número específico de células alvo com diferentes concentrações das células imunitárias, juntamente com controlos adequados. A co-cultura permite que as células efectoras induzam apoptose e Lise nas células-alvo, resultando na libertação do crómio intracelular 51 para o sobrenadante. Em seguida, num ponto de tempo preoptimizado, o sobrenadante contendo o crómio libertado é colhido em todos os poços. O crómio 51, sendo radioactivo, sofre espontaneamente decaimento radioactivo para emitir radiação gama. Os níveis de radiação gama nos sobrenadantes de todos os alvéolos da placa de ensaio representam uma saída quantificável da lise das células-alvo. Este valor é medido utilizando um contador gama, que é então utilizado para determinar o potencial citotóxico das células imunitárias.
no início, as células alvo, a linha de células de melanoma humano WM793 neste exemplo, são preparadas para uma única suspensão celular. Para isso, primeiro remova o meio do frasco de cultura de tecidos e lave as células com cinco mililitros de 1X PBS. Decantar o PBS e depois adicionar um mililitro de tripsina à placa durante aproximadamente dois minutos. Bata suavemente no frasco para retirar as células da superfície do frasco e, em seguida, adicionar cinco mililitros de meio RPMI ao frasco. Pipetar o meio para cima e para baixo para recolher as células e adicionar esta suspensão a um tubo cónico de 15 mililitros.Colocar o tubo na centrifugadora durante cinco minutos a 1200 RPM. Em seguida, remova a mídia do tubo, certificando-se de não interromper a célula pellet. Balance suavemente o fundo do tubo para interromper o sedimento da célula e adicione 10 mililitros de meios ao tubo. Em seguida, pipetar suavemente o meio para cima e para baixo para colocar as células em suspensão. Em seguida, determinar a concentração celular usando um hemocitómetro e transferir dois mililitros da suspensão celular original para um novo tubo cónico de 15 mililitros. Coloque o tubo numa centrifugadora e espalhe as células a 1200 RPM durante cinco minutos. Após centrifugação, verter o excesso de meio do tubo para um recipiente de resíduos. Vórtice breve o tubo para ressuspender o sedimento da célula no pequeno volume de meio deixado para trás.Em seguida, prepare-se para usar o crómio 51 movendo-se para um espaço de laboratório dedicado a esta radioatividade particular. Deve haver uma ampla blindagem de chumbo para armazenamento seguro e utilização do crómio 51 durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde estão a ser mantidas amostras com crómio 51. Um contador Geiger equipado com uma sonda pancake também é necessário para servir no espaço para uma possível contaminação.
uma vez estabelecido para a utilização adequada da radioactividade, adicionar 100 microcuries de crómio 51 directamente à suspensão da célula-alvo. Em seguida, adicionar um pequeno pedaço de fita radioativa para o tubo para indicar que a amostra e tubo são agora radioativos. Colocar o tubo em uma incubadora de 37 graus celsius com um escudo de chumbo e incubar por uma hora, piscando o tubo a cada 15 a 20 minutos.
enquanto as células alvo estão rotulando, prepare uma única suspensão celular de células efetoras. Neste exemplo, células mono-nucleares do sangue periférico humano, ou PDMCs, foram isoladas do sangue total por centrifugação padrão de gradiente de densidade para uma concentração de 5 vezes 10 a 6. Transferir esta suspensão da célula efectora para um reservatório de reagente descartável e, em seguida, adicionar 200 microlitros desta suspensão em cada poço da linha B numa placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicionar 100 microlitros de RPMI a cada poço na linha C A G da placa.
Agora, começar a efectuar diluições em série das PBMCs ter um intervalo de números de células efetoras, primeiro removendo 100 microlitros das células nos poços na linha B e adicionar esta linha C. em Seguida, diluir ainda mais as células efetoras por transferência de 100 microlitros de células a partir da linha C linha D. Continue a diluição em série. Uma vez atingida a linha G, mova 100 microlitros dos poços para deixar um volume final de 100 microlitros em cada poço dessa linha. Em seguida, adicionar 100 microlitros de meio de cultura de tecidos aos poços na linha a para servir como um controle para a libertação espontânea de crómio 51 a partir das células alvo, uma vez que não devem ser adicionadas células efetoras a esta linha. Em seguida, coloque uma placa em uma incubadora de 37 graus celsius até que as células alvo estejam prontas para ser adicionadas.
após o período de incubação, remover as células-alvo da incubadora e lavar com 5 mililitros de FBS para remover qualquer excesso de crómio 51. Depois, coloque o tubo numa centrifugadora designada e gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retirar a lavagem radioactiva de FBS num contentor de resíduos adequado e repetir a etapa de lavagem, ressuspendendo o sedimento num líquido fresco de 5 mililitros de FBS. Colocar o tubo numa centrifugadora designada e rodar as células novamente a 1200 rpm durante 5 minutos. Remover a segunda lavagem e verificar a radioactividade incorporada no sedimento com um contador Geiger. Finalmente, Ressuspender o sedimento em 10 mililitros de meio completo e colocar o cromo 51 rotulado, suspensão de células alvo em um reservatório de reagente descartável. Em seguida, adicione 100 microlitros destas células alvo rotuladas a cada poço da placa de células efetoras de 96 poços. Em seguida, adicionar 100 microlitros de 1% NP-40 em água para os poços na linha H para lyse todas as células alvo em cada linha. Estes poços serão usados como um controle para determinar as contagens totais por minuto, ou cpm.
agora que a placa está preparada, fixar a tampa adicionando um pequeno pedaço de fita em cada lado da placa e colocar um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém crómio 51. Em seguida, coloque a placa em uma centrifugadora marcada para lidar com amostras radioativas. Se for utilizada apenas uma placa experimental, adicionar uma placa de balanço à centrifugadora. Ajusta a centrifugadora para 1200 rpm, e actualiza a placa. Uma vez na velocidade, pare a máquina. Retirar a placa da centrifugadora. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus celsius com um pequeno pedaço de escudo de chumbo sobre a placa para segurança adicional. Incubar durante 16 horas para permitir que as células alvo se lirem.
no final do período de incubação, remover cuidadosamente a fita em torno do bordo da placa e remover a tampa. Em seguida, coloque a moldura de colheita na placa, certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada uma das tomadas de algodão. Agora, devagar e suavemente pressione as ligações de algodão para os poços. Depois de aproximadamente dez segundos, libere a pressão sobre as tomadas de algodão, e em seguida, transferir as tomadas de algodão para tiras de tubos. Colocar cada um destes tubos num tubo de FACS secundário. Por último, carregar os tubos FACS num contador gama e analisar as amostras para quantificar a quantidade de crómio 51 libertada em cada condição. Registar cuidadosamente a ordem pela qual os tubos foram carregados no balcão.
aqui, PBMCs não estimulados foram adicionados às primeiras 3 faixas e PMBCs estimulados por CPG foram adicionados às faixas 4 a 6. Neste exemplo, as contagens por minuto foram introduzidas nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram colocadas na placa original e as médias dos triplicados foram calculadas. Por exemplo, para a primeira condição, as células A1, A2 e A3 foram médias na célula I3. Uma vez que as médias são determinadas, a percentagem de lise específica para cada condição pode ser calculada usando esta fórmula. Por exemplo, para calcular a lise por cento específica para as células não estimuladas que tinham uma razão de 50 para 1 células efetoras para as células alvo a CPM espontânea, que neste exemplo, é 1164.67, foi subtraída da CPM experimental, 1129. 67. Este número pode então ser dividido pela diferença entre o CPM máximo e o CPM espontâneo, e então multiplicado por 100 para dar a lise por cento específica. Isto é então calculado para cada condição. Estes dados podem então ser graficados para mostrar a comparação da razão E para T com a lise por cento específica para ambos os PBMCs não estimulados, e o CPG estimulado PBMCs. Neste exemplo, as células efetoras estimuladas com CPG mais efetivamente mataram as células alvo à medida que a razão entre as células efetoras e as células alvo aumentava. Este aumento não foi observado nos CPSP não estimulados, indicando que a estimulação CPG é necessária para o aumento observado na lise celular alvo.