cromossoma Y microdeletion em um pai e seus quatro inférteis filhos

Resumo

Microdeletions de Yq estão associados com azoospermia e oligospermia grave. Em geral, os homens com deleções são inférteis e, portanto, as deleções não são transmitidas aos filhos a menos que sejam realizadas fertilização in-vitro (FIV) e injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI). Relatamos uma família incomum caracterizada por múltiplos membros com infertilidade e microdeleção Yq. Os antecedentes reprodutivos completos, as análises de sémen e as amostras de sangue foram obtidos a partir de membros da família relevantes. A preparação e quantificação do ADN foram realizadas utilizando kits comerciais. Um total de 27 pares de conjuntos de iniciadores de sequência marcados com base em locais específicos para a região de y microdeletion loci foram usados para triagem. As blots do Sul que utilizam cdnas deletadas em azoospermia (DAZ) e ribosomal binding motif (RBM) foram então analisadas para confirmação. The proband, his three brothers and father were all found to be deleted for DAZ but not RBM. No momento da análise, o pai do proband era azoospérmico, enquanto seus quatro filhos eram severamente oligozoospérmicos ou azoospérmicos. Ao contrário de seu pai, os quatro filhos são inférteis e não têm filhos, exceto para um deles que alcançou uma filha apenas após o tratamento de infertilidade FIV/ICSI. Microdeletions of Yq involving the DAZ gene are associated with a variable phenotypic expression that can include evidentemente normal fertility.

Introdução

Infertilidade ocorre em cerca de 14% dos casais (Mosher, 1985) e anormalidades no parceiro masculino são estimados para estar presente em até metade dos casos (Swerdloff et al., 1985). Os esforços para avaliar as causas da azoospermia demonstraram que, após a exclusão de causas tradicionalmente reconhecíveis (isto é, cariótipo anormal, obstrução, varicocoele, defeito hormonal, etc.), a maioria dos casos (50-75%) são inexplicáveis e são denominados idiopáticos (Pryor et al., 1997). Recentemente, foi relatado que até 30% dos homens com azoospermia “idiopática” têm microdelecções do cromossoma Y (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Exatamente como e se essas microdeletions causam ou não azoo/oligozoospermia é objeto de intensa investigação e debate.

essencial para o argumento de que as microdeleções causam infertilidade é a observação de que os homens férteis raramente manifestam microdeletções Y. Foram notificadas microdeleções em quatro dos 200 homens férteis estudados (Pryor et al., 1997). No entanto, as supressões nestes homens eram muito pequenas e muito provavelmente representavam polimorfismo insignificante. Supressões relativamente grandes do tipo associado à infertilidade masculina não foram notificadas em homens com fertilidade normal. Embora seja geralmente assumido que estas supressões surgem de novo e que a transmissão de microdeleção de pai para filho não seria de esperar, algumas raras instâncias de transmissão de pai para um filho do cromossomo Y foram relatadas (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). No entanto, a transmissão vertical de uma microdeleção envolvendo a deletada em azoospermia (DAZ) locus de pai para filho foi relatada em apenas três casos (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Descrevemos agora uma família de quatro gerações na qual um pai azoospérmico e os seus quatro filhos inférteis partilham uma microdeleção aparentemente idêntica que inclui o DAZ locus. Esta família representa o primeiro e único relato de transmissão vertical espontânea da supressão da DAZ para múltiplos descendentes. Ela fornece evidências de que uma única microdeleção Yq pode resultar em diferentes expressões fenotípicas em diferentes indivíduos. É clinicamente significativo, na medida em que a presença de uma microdeleção não é um marcador absoluto para a infertilidade e pode ser associado com fertilidade aparentemente normal.

materiais e métodos

Screening for Yq microdeletion was performed on a routine basis for male infertility using a protocol reviewed and approved by the Institutional Review Board of College of Physicians & Surgeons, Columbia University. Foram colhidas amostras de pacientes após consentimento informado.Os resultados da análise do sémen

foram analisados utilizando critérios da OMS com um microscópio de contraste de fase Nikon.

as concentrações de hormona sérica

hormona folículo estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH) e testosterona foram medidas por teste imunométrico de fase sólida de duas enzimas quimioluminescentes (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, EUA). Os intervalos normais para os homens são FSH < 10 mUI/ml; LH <10 mUI/ml; e testosterona 270-1070 ng / dl.

ADN genómico

a extracção do ADN genómico do sangue total foi efectuada por lise de glóbulos vermelhos, seguida por lise de glóbulos brancos e dos seus núcleos. As proteínas celulares foram removidas por precipitação de sal, e o DNA genômico foi precipitado com isopropanol usando kit de extração de DNA de Puregeno (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; catalogue no. D-5004).

polimerase chain reaction (PCR)

Primers were produced as dried oligonucleotides on an automatic DNA synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Um total de 27 y sítios de sequências específicas do cromossoma (STS) (Figura 1) foram seleccionados de um mapa STS (Vollrath et al., 1992). Eles incluem as três propostas de espermatogénese loci AZFa, AZFb e AZFc (como per Vogt et al., 1996), abrangendo intervalos QNG de 5, 6 e 7. Como um protocolo de triagem rápida, um sistema multiplex PCR composto de dois a seis pares de iniciadores diferentes foi usado em um total de seis reações multiplexadas (Tabela I). Com cada execução de PCR, um controle feminino e um controle masculino normal foram incluídos. Todas as reações PCR foram executadas em placas de policarbonato (Techne®) em uma máquina MJ Research®. As condições PCR foram essencialmente as descritas anteriormente (Henegariu et al., 1993). Brevemente, em 14 µl volume total de reação, 50 ng de DNA genômico foi usado como modelo, 1 µl de primer solução padrão (mix I ou II ou III ou IV ou V ou VI, consistindo em 10 pmol por primer), 12 µl de `PCR de mistura a frio’ (1.5 mmol/l de MgCl2, de 0,2 mmol/l de cada mistura de dntp, 5% de DMSO, 1× Taq polimerase reação buffer sem Mg2+), de 1,25 U de Taq DNA polimerase (Promega) e 1 gota de óleo. As misturas completas foram colocadas directamente num termociclador pré-aquecido a 94 ° C.: 94 ° C, 30 s (fusão); 55°C, 45 s (recozimento); e 72°C, 60 s (extensão). O tempo de extensão final foi de 5 minutos. Os produtos da reacção PCR foram então separados em 3% de géis de agarose (Bio-Rad, grau ultra-puro) por electroforese no tampão TBE. Os produtos PCR foram manchados com brometo de etídio e visualizados pela exposição à luz ultravioleta. As STS que não revelam amplificação em reacções multiplex foram confirmadas por uma única reacção PCR com controlos positivos e negativos adequados. Uma STS foi considerada ausente após três falhas de amplificação.

hibridação Sul

Southern blotting was performed according to established protocol (Sambrook et al., 1989). Resumidamente, 5 µg de DNA genômico foi digerido com HindIII ou TaqI, executado em um gel de agarose de 0,7% em tampão TBE padrão, transferido para uma membrana de nylon, e hibridizado com 32 sondas marcadas com 32P. A sonda DAZ foi a inserção purificada de um plasmídeo (pDP1577) contendo o cDNA de comprimento completo (Reijo et al., 1995). Da mesma forma, a sonda RBM foi a inserção plasmídica de um clone cDNA RBM (Mk5) (Ma et al., 1993).

determinação da paternidade

paternidade de todos os quatro filhos foi confirmada mostrando a segregação esperada de quatro marcadores autossômicos altamente polimórficos (Weber e maio de 1989). Estes foram D21S156, D21S270, D13S132, e D13S159 com heterozigosidades de 0,83, 0,86, 0,84 e 0,90 respectivamente.

hibridização in situ fluorescente (FISH)

FISH for DAZ foi realizada com Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), usando métodos estabelecidos (Yu et al., 1996).

resultados

o proband (indivíduo III 8 Na Figura 2) e o seu cônjuge (III-9) apresentados à clínica reprodutiva-Endocrinologia-infertilidade no Centro Médico Columbia-Presbiteriano com queixa de infertilidade primária por 3 anos. Os testes revelaram níveis normais de cariótipo e de hormona sérica, enquanto as análises ao sémen revelaram oligozoospermia grave (Tabela II). O rastreio da microdeleção por PCR baseado na STS revelou a presença de uma microdeleção na subinterval 6D–6F do braço longo do cromossoma Y (Figura 1). Durante a discussão, o proband relatou que seus dois irmãos mais velhos (III-4 e III-6) eram conhecidos por serem azoospérmicos e inférteis. Trabalhos posteriores revelaram que todos os três irmãos tinham uma microdeleção aparentemente idêntica. A biópsia Testicular realizada num deles (III-6) demonstrou síndrome de “apenas célula de Sertoli”.

a descoberta da microdeleção em três irmãos inférteis sugeriu que o seu pai provavelmente carregaria a mesma deleção. Um estudo detalhado foi realizado sobre o restante da família que todos residiam em uma pequena cidade na República Dominicana. Um histórico reprodutivo completo foi obtido dos membros da família adulta. As relações familiares representado na árvore (Figura 2) foram confirmadas pela esperado segregação de vários autossômica marcadores polimórficos (dados não apresentados) para os membros da família (I-1, I-2, II-1, II-8 e II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Não havia provas de não paternidade. Minuciosos estudos citogenéticos sobre os membros da família (I-1, II-1, II-6, II-8, I-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19, e IV-1) revelou cariótipo normal. A análise do sémen foi realizada em sete dos 16 machos e foram obtidas amostras de sangue da maioria dos membros da família.

a Tabela II resume os resultados da análise do sémen e do trabalho endócrino sobre os familiares relevantes. O proband (III-8), seu pai (II-1) e dois de seus três irmãos (III-4, III-6) foram encontrados para ser azoospermia ou gravemente oligozoospermic. O irmão mais velho de proband (III-1) declinou a análise do sémen. Além disso, verificou-se que o tio do proband (II-8) tinha azoospermia e FSH elevado com testosterona baixa. Como mostrado na Figura 1, o proband, seu pai e três irmãos foram todos encontrados para ter microdeleção de Yq pela análise da STS PCR. Southern blotting with the DAZ (Figure 3) and RBM (data not shown) probes confirmed that the deletion included the DAZ locus but not the RNA binding motif (RBM) locus. FISH analysis with the DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) dos leucócitos do pai de proband (II-1) mostraram ausência uniforme do Daz locus (Figura 4).

a descoberta de que o indivíduo II-8 no pedigree era azoospérmico mas não tinha uma microdeleção foi uma surpresa. O locus DAZ neste indivíduo foi ainda testado pela análise Sul usando o cDNA DAZ e uma enzima de restrição diferente (TaqI). Não mostrou nenhuma anomalia no DAZ locus. Além disso, os peixes com o Cosmídeo DAZ 63C9 mostraram intensidade normal (dados não apresentados).

the proband (III-8) and his older brother (III-6) were seeking infertility treatment. Após um amplo aconselhamento, optaram pela fertilização in-vitro (FIV) e injecção intracitoplasmática de esperma (ICSI). O proband (III-8) e sua esposa (III-9) passaram por dois ciclos de FIV-ICSI que não conseguiram produzir uma gravidez secundária à fraca resposta ovárica. O irmão de proband (III-6) e sua esposa (III-7) passaram por um ciclo de hiperestimulação ovárica controlada e nove oócitos foram recuperados. Onze espermatozóides maduros foram encontrados em três ejaculados no dia da recuperação e usados para ICSI. Três oócitos fertilizados que posteriormente se decompuseram e foram transferidos. Ela deu à luz um bebê fêmea saudável (IV-2).

Discussão

relatamos um excepcional da família em que um azoospermia pai e seus quatro inférteis filhos compartilhar um aparentemente idênticas Yq microdeletion envolvendo o DAZ locus. A mutação de novo que levou à microdeleção de DAZ parece ter se originado no Pai do proband (II-1). Esta exclusão é esperada para causar azoo / oligozoospermia e infertilidade masculina, e ainda assim ele espontaneamente concebeu cinco crianças e não tinha conhecimento de qualquer problema de fertilidade. Curiosamente, no entanto, todos os quatro filhos são inférteis e ou são azoospérmicos ou severamente oligozoospérmicos.

esta família levanta várias questões no que diz respeito à associação entre microdeleção Yq e infertilidade. Em primeiro lugar, confirma que a transmissão vertical da microdeleção Yq é possível e pode levar à infertilidade subsequente na descendência masculina. Em segundo lugar, é óbvio que a mesma exclusão pode resultar em diferentes fenótipos em indivíduos diferentes. Embora o pai (II-1) dos quatro meninos desta família fosse azoospérmico no momento da análise, ele teve seu primeiro filho aos 25 anos de idade e seu último aos 38 anos de idade. Assim, ele possuía algum grau de fertilidade ao longo de um grande período de anos. Da mesma forma, a microdeleção do cromossomo Y, especificamente DAZ, não implica necessariamente uma história de azoospermia ao longo da vida nem impede a formação de uma grande família. Seus quatro filhos, por outro lado, são inférteis e azoospérmicos ou severamente oligozoospérmicos.

o gene DAZ foi proposto como o factor azoospermia no cromossoma Y. Esta família mostra claramente que, embora DAZ possa ter um papel crítico na espermatogénese, não é essencial para a fertilidade. Além disso, a perda total do cluster genético DAZ pode ser associada a um quadro histológico de “apenas células Sertoli”, bem como à paragem da maturação do esperma (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Vários autores encontraram uma fraca correlação entre a localização das microdeleções Y (incluindo deleções DAZ) com o fenótipo clínico e histológico dos pacientes (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Os achados nesta família concordam que tal correlação pode se revelar bastante problemática. Biópsia Testicular de o proband irmão (III-6) mostrou uma imagem de “célula de Sertoli apenas” considerando que o proband (III-8 com a contagem de esperma 0.5×106/ml) claramente seria de esperar para ter algum grau de maturação do esperma na biópsia. Além disso, a biópsia testicular pode não ser representativa de todo o testículo porque pode haver heterogeneidade geográfica para a espermatogénese como no indivíduo III-6, cujos ejaculados continham espermatozóides maduros.

só podemos especular sobre a base para diferenças fenotípicas entre membros da família com a mesma exclusão. É bem conhecido que supressões idênticas dentro dos autossomas podem resultar em diferentes fenótipos (Schinzel, 1994). Pode-se postular que tais diferenças são consequências da exposição de cada indivíduo ao seu ambiente ou expressão de vários genes modificadores. Um pai fértil foi descrito com uma microdeleção que se alargou quando transmitido ao seu filho infértil (Stuppia et al., 1996). Embora as extensões variáveis nas fronteiras da exclusão possam existir entre os nossos diferentes membros da família, estas extensões moleculares não podem ser distinguidas pelo mapeamento de intervalos. Pela análise PCR, o mesmo STSs falhou em amplificar em nossos cinco indivíduos e hibridização do Sul com a sonda DAZ confirmou uma eliminação completa deste aglomerado genético. Embora seja possível que as exclusões observados são, na verdade, não são idênticos e áreas adjacentes podem conter genes importantes que modulam o grau de expressão fenotípica, estes resultados ainda indicam uma grande sobreposição dos excluídos Y-DNA (incluindo a perda de DAZ gene cluster) em cada indivíduo dessa família especial.Ficamos fascinados pelo fato de que o tio de proband (II-8) tem infertilidade e azoospermia, mas não tem microdeleção aparente por testes de STS. Uma vez que a análise de Southern blot usando tanto as sondas RBM e DAZ, bem como as análises de peixes usando um cosmídeo DAZ eram todos inteiramente normais, somos forçados a concluir que ele tem uma etiologia diferente subjacente à sua infertilidade. Reconhecidamente, é possível que ele possa ter uma mutação/perturbação menor ou pontual ou rearranjo proximal/distal que não é detectável pelos métodos atuais. He gave no history of exposure to gonadotoxins or other definable factors that were likely to affect espermatogenesis.

até recentemente, a microdeleção Y teve pouco significado clínico, uma vez que um homem com uma deleção não se reproduzirá, em geral. No entanto, utilizando ICSI e aspiração testicular de espermatozóides (TESA), combinada com FIV, é agora possível para os homens oligo/azoospérmicos com microdeleção y alcançar gravidezes (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, e individual III-6). Isto tem fomentado preocupações de que tais gravidezes podem produzir descendência masculina com microdeleções semelhantes e infertilidade subsequente (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Na verdade, a microdeleção Yq pode ser transmitida à descendência masculina através de ICSI (Kent-First et al., 1996). A família que reportamos sugere que os homens com microdeletions Yq (como o indivíduo II-1) que conseguem gravidezes transmitirão a mesma microdeletação e o risco de infertilidade para seus filhos (indivíduos III-1, III-4, III-6, III-8). Portanto, os pacientes devem ser oferecidos y microdeletion screening antes do ICSI e eles devem ser aconselhados sobre a certeza de transmitir a microdeletion Yq e possivelmente infertilidade para seus filhos. À medida que mais pesquisas são focadas em etiologias genéticas da infertilidade masculina, a identificação dos genes envolvidos na espermatogênese deve fornecer uma visão sobre a fisiopatologia da infertilidade masculina e uma base mais racional para iniciar a terapia.

agradecemos as famílias para a cooperação em estudo; Dr. David C. Página para fornecer o DAZ sonda de cDNA e sua inestimável ajuda com este manuscrito; Dr. Kun Ma para fornecer o MK5 (RBM1) sonda de cDNA; Dr. Peter Vogt para o DNA de indivíduos com microprocessadores Yq usados para validar a nossa metodologia STS PCR; e C. C. Yu e Patricia Lanzano para a sua valiosa assistência técnica.

este estudo foi financiado em parte pelo Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.