Cromossoma 20 eliminações em neoplasias mielóides: redução do comum excluídos região, geração de um PAC/BAC contig e identificação de genes candidatos

Cromossomo bandas e pintura

medula Óssea cromossomo preparações de 107 casos com mielóide transtornos foram analisados pelo bandamento G para avaliar o tamanho da deleção do braço longo do cromossomo 20. Como descrito anteriormente (Nacheva et al., 1995b), foram identificadas duas categorias de deleção 20q – grandes deleções (59 casos), resultando na perda de ambas as bandas escuras Giemsa de 20q (figura 1a, top), e pequenas deleções (48 casos) em que permanece uma banda escura Giemsa (figura 1a, bottom). Em seguida, focamos o último grupo de pacientes (resumido na Tabela 1).

PEIXES análise, usando um cromossomo 20 a pintura foi executada em 48 amostras com uma pequena 20q exclusão. Em seis casos, a “supressão 20q” foi revelada como sendo devido a rearranjos crípticos. Num caso, a aplicação simultânea de tintas para cromossomas 15 e 20 identificou um marcador derivado do cromossoma 15, mas dois homólogos do cromossoma 20 normal (figura 1b). Nos restantes cinco casos, a pintura cromossómica demonstrou a presença de uma translocação desequilibrada com um ponto de paragem recorrente no 20T11.2 e parceiros cromossómicos variáveis (figura 1c). Em todos os cinco casos, o marcador der(20) foi o único produto de translocação retido no genoma. Além disso, o mapeamento do FISH mostrou que o ponto de ruptura do cromossoma 20 ocorreu numa região próxima do D20S107 e confirmou a perda do resto do braço longo do cromossoma 20 (Dados Não apresentados). Estes resultados serão comunicados em pormenor noutro local.Nos restantes 42 casos, a pintura cromossómica foi consistente com uma pequena deleção intersticial de 20q (figura 1d). A maioria (33 casos) levou uma supressão de 20q como a única anormalidade cariotípica. Nos restantes nove casos, a supressão de 20q foi acompanhada de várias aberrações cromossómicas adicionais (Quadro 1). Todos os 42 casos com uma pequena remoção de 20q foram submetidos a um mapeamento adicional de peixes com sondas específicas locus.

Exclusão de mapeamento de análise

42 pacientes com pequenas 20q eliminações foram analisados pelo PEIXE usando um centromeric PAC (CEP20), um PAC hibridizar para uma região distal do 20q (LSI 20q13) e um PAC hibridizar dentro do CDR (LSI D20S108). Em cada doente foram observados sinais tanto da LSI 20q13 como da CEP20, mas não da LSI D20S108, no cromossoma 20 deletado, confirmando a presença de uma deleção intersticial (resumida na Figura 3). Metafases de cada paciente foram então hibridizadas com o mapeamento PACs nos limites do conhecido MPD e MDS / AML CDRs-D20S107 que se encontra no limite proximal do CDRs e D20S176 que se encontra telomérico do limite distal do CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

Em 37 pacientes (25 com o MDS ou LMA, 12 MPD) ambas as sondas não conseguiu produzir um sinal na eliminação de cromossomo 20, demonstrando a presença de extensas supressões que não iria ajudar a refinar os CDRs. Essas amostras não foram investigadas mais aprofundadamente. No entanto, em quatro doentes com MDS (DB53, MH40, DB122 e DB214) e um com MPD (JH41) uma das duas sondas deu um sinal no cromossoma 20 eliminado e estas amostras foram analisadas com mais pormenor.

para além dos 42 doentes com pequenas supressões de 20q que foram analisados por peixes utilizando sondas específicas de locus, foram analisados mais seis doentes com uma deleção de 20q (quatro com MDS, dois com MPD), dos quais não estavam disponíveis metafases da medula óssea, utilizando PCR de microsatelite. O ADN dos granulócitos purificados e das células T foi analisado através de um grande painel de marcadores polimórficos que abrangeram os CDRs MPD e MDS/AML (Quadro 2). Todos os quatro doentes com MDS tiveram supressões que ultrapassaram os limites do CDR publicado. No entanto, em um dos dois pacientes MPD (RB42), o limite centromérico da supressão reduziu consideravelmente o MPD CDR (Figura 2, Quadro 2).

redução da região eliminada comum em doentes com MDS/AML

a análise preliminar do peixe identificou quatro doentes com MDS com supressões que invadiram o MDS/AML CDR. Em cada caso, a supressão de 20q estava presente em todas as metafases examinadas. Em três casos (DB53, DB214 e MH40), a deleção 20q estava presente como uma única anomalia. No doente DB122, a deleção de 20q foi a única anomalia original com duas subclonas contendo trisomia 21 ou trisomia 8 e trisomia 21, além da deleção de 20q também presentes. Estes quatro casos foram estudados utilizando sondas específicas de locus adicionais, a fim de determinar os limites de supressão.

a fronteira proximal do MDS/AML CDR foi refinada pelos doentes DB53, MH40 e DB122. O limite proximal da deleção em DB53 estava entre D20S107 e WI-11538 (Figura 3), uma distância de aproximadamente 400 kb. Para o paciente MH40, um PAC contendo WI-11538 (dJ357E14) deu consistentemente origem a um sinal reduzido consistente com a presença do ponto de ruptura da deleção proximal dentro deste PAC (Figura 3). Além disso,o limite proximal da eliminação no paciente DB122 estava entre sts-R52161 e stSG25449 (figura 1e, f), uma distância inferior a 200 kb (Figuras 3 e 4). Isto representa um grande refinamento do limite proximal do MDS / AML CDR.

O paciente DB214 permitiu um refinamento considerável do limite distal do MDS / AML CDR. O limite distal desta supressão estava entre WI-12515 e stSG40369 (figura 1g,h), uma distância inferior a 100 kb (Figuras 3 e 4).Estes dados reduzem consideravelmente o MDS / AML CDR para uma região situada entre PAC dJ620E11, que contém sts-R52161, e PAC dJ196H17, que contém WI-12515 (Figuras 3 e 4). O clone bacteriano contig apresentado abaixo demonstra que o tamanho físico desta região é de aproximadamente 2,6 Mb.

redução da região deletada comum em doentes com DMP

no doente JH41 (diagnóstico PV), o limite proximal da deleção tinha sido previamente determinado pela PCR microssatelite como estando entre D20S438 e D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, que contém D20S107( Figura 4), deu consistentemente origem a um sinal reduzido consistente com a presença do ponto de ruptura da deleção proximal dentro deste PAC (Figura 3).Foram investigados granulócitos e células T

de dois doentes adicionais utilizando PCR de microsatelito (Tabela 2). Um doente com PV (RB42) demonstrou retenção de heterozigosidade a D20S108 mas perda a D20S858 (Figura 2, Tabela 2). O ponto de ruptura proximal da eliminação neste paciente estava entre D20S108 e D20S858, uma distância de menos de 200 kb (Figuras 3 e 4).

estes dados reduzem consideravelmente o MPD CDR whicih é agora flanqueado por D20S108 (este estudo) e D20S481 (Wang et al., 1998). O tamanho físico estimado desta região é de 2.7 Mb, utilizando dados do clone bacteriano contig abaixo apresentado. A região de sobreposição entre o novo MDS/AML e CDRs MPD definiu um “mielóide” combinado CDR de 1,7 Mb (Figura 3).

um clone bacteriano contig que abrangia as regiões deletadas comuns MPD e MDS/AML

tínhamos construído anteriormente um YAC contig de 11 Mb desta região do cromossoma 20 (Bench et al., 1998a). A fim de produzir um mapa físico mais detalhado, nós construímos agora um PAC contíguo e BAC baseado mapa. Clones PAC e BAC foram identificados por hibridização de STSs para bibliotecas genômicas (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Clones foram sobrepostos usando impressões digitais restriction (Gregory et al., 1997) e mapeamento de conteúdo STS permitindo que clones sejam agrupados em contigs. Para bridge contigs, novas sondas de DNA e STSs, desenvolvidas a partir das extremidades de contigs, foram usadas para posterior triagem na biblioteca. Novos PACs e BACs foram então amalgamados em contigs da mesma forma até que um mapa contíguo foi produzido.

O clone bacteriano contig contém um total de 456 clones bacterianos dos quais 376 São PACs e 80 são BACs. Estende-se desde D20S607 até SEMG1 e inclui 202 marcadores de ADN dos quais 185 são STSs e 17 são sondas de ADN. O tamanho do contig foi baseado em uma média de 3,5 kb por banda de impressões digitais HindIII (P Deloukas (2000), resultados não publicados). O tamanho estimado do contig foi calculado em 5 Mb multiplicando o número total de diferentes faixas de impressões digitais dentro do contig em 3,5. A Figura 4 mostra uma representação do mapa ilustrando o caminho mínimo de azulejo e os PACs utilizados para experiências com peixes. Uma versão completa do mapa pode ser encontrada em http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name = Chr_-20ctg125&class = Map.

identificação das sequências expressas

quarenta e três ESTs únicos foram localizados entre D20S607 e stSG34035 inclusivamente. Destes, 34 ESTs foram mapeados por hibridação a um “polígrido” de PACs e BACs ou por Colonia PCR de colônias bacterianas contendo PACs ou BACs (Figura 4). Mais nove ESTs, previamente mapeados nesta região do cromossoma 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) foram posicionados sobre o contig por Alinhamento de explosão da sequência EST com a sequência genômica PAC ou BAC disponível.

A fim de identificar sequências expressas de romance putativo, 23 clones PAC do caminho mínimo de azulejo foram parcial ou completamente sequenciados. A sequência genómica destes clones foi analisada utilizando o programa NIX (Williams et al., 1998) que permite a Observação Simultânea de uma série de ferramentas de identificação genética, incluindo Graal, GENSCAN e BLAST. Foram identificados oito ETS e genes não mapeados anteriormente (Quadro 3). Seis deles estavam dentro do MPD CDR e sete estavam dentro do MDS CDR. Evidências foram obtidas de que seis dessas oito sequências expressas por putativos representavam genes transcritos de boa fé, em vez de pseudogenes processados ou contaminantes de DNA genômico dentro da base de dados EST. KCNS1 é um gene que codifica uma subunidade de canal com voltagem de potássio. ESTs AA053206 / AA053121 foram posteriormente encontrados como derivados do gene SGK2 (Kobayashi et al., 1999). O alinhamento da sequência cDNA com a sequência genómica demonstrou uma estrutura de exon / intron para três dos seis ESTs restantes (AI312497, AA568401 e AA910031) com a sequência de consenso no local de splice presente em todos os limites de exon/intron. Em todos estes três casos, a presença de cada exon foi confirmada por programas de predição de exon, como o Graal. A existência de um exon também foi prevista pelo Graal, GENSCAN e Genefinder dentro da região de PAC dJ1108D11, que se alinhou ao est AA993161, implicando que este EST também representava um gene transcrito.

a análise de sequência de PACs a partir de dentro do caminho mínimo de azulejos também nos permitiu estabelecer a estrutura genômica de genes conhecidos e novos nesta região. Alinhamento do cDNA RPTPrho com o PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 e dJ269M15 demonstrou que este gene abrange pelo menos 1,2 Mb. PAC dJ138B7 continha dois genes (h-l(3)mbt e SGK2), bem como a porção de 5′ do gene correspondente a SHGC-36858. In particular, theh-l(3)mbt gene contains 20 exons with two putative alternative final exons. A análise do dJ644L1 demonstrou que o gene humano MafB consiste de um único exon. A análise da sequência final também foi realizada pelo Sanger Centre (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) e isso pode ser visto em http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&classe=Genomesequência.

estes dados estabelecem a presença de seis genes e de outros 14 ETS unqiue dentro do novo MDS/AML CDR e um total de 14 genes com 23 ETS únicos dentro do novo MPD CDR (Quadro 3). Seis genes e 10 ESTs únicos estão presentes na região de sobreposição entre os dois CDRs.Pensa-se que as alterações mieloproliferativas, as síndromes mielodisplásicas e a leucemia mielóide aguda resultam da transformação de uma célula multipotente no compartimento das células estaminais hematopoiéticas (Bona e Dick, 1997; Kralovics e Prchal, 1998). Além disso, já foi demonstrado anteriormente que a eliminação de 20q pode surgir numa célula progenitora capaz de dar origem tanto às células mielóides como às células B (brancas e outras., 1994). Estas considerações sugerem que é provável que o gene ou genes do cromossoma 20q inactivados nestas doenças sejam expressos em células progenitoras hematopoiéticas normais. Determinámos, portanto, qual das sequências transcritas foi expressa em medula óssea e células CD34 positivas purificadas.A amplificação por PCR (RT–PCR) foi realizada com iniciadores representando cada uma das 51 sequências transcritas (Figura 5). Pelo menos duas amplificações RT–PCR independentes foram realizadas para cada sequência transcrita. Os iniciadores correspondentes a um EST (WI-7685) derivado do 3′ UTR do gene CD34 foram usados como um controle positivo (Figura 5). Onde dois ou mais ESTs correspondiam à mesma sequência transcrita, o mesmo resultado foi obtido para cada EST.

Os dados são apresentados na Figura 5, Tabelas 3 e 4. Das 37 sequências expressas no MPD CDR, 20 foram expressas em células mononucleares da medula óssea. Destes, 16 foram também expressos em células CD34 positivas. Dentro do MDS / AML CDR, 11 de 20 sequências transcritas foram expressas em células mononucleares da medula óssea. Destes, oito foram também expressos em células CD34 positivas. Das 16 sequências transcritas que se encontram na região de sobreposição entre os CDM e os CDRs MDS/AML, oito foram expressas em células da medula óssea, das quais cinco foram também expressas em células CD34 positivas. Estas cinco sequências transcritas representam, portanto, genes candidatos a prime, uma vez que se encontram dentro dos CDRs MPD e MDS/AML e são expressos dentro do compartimento das células progenitoras hematopoiéticas. Eles incluem dois genes desconhecidos correspondentes a ESTs SHGC-36858 e WI-12515, bem como três genes, SFRS6, h-l(3)mbt e MYBL2.