Como realizar a extração de DNA a partir de manchas de sangue secas usando resina Chelex

cada bio-cientista que quer analisar o DNA sabe que o processo começa com a extração de DNA a partir de células de interesse. Estas células podem ser RBC, parasitas, ou bactérias para citar alguns. Além disso, existem vários métodos de extração de DNA1 para escolher, dependendo do tipo de amostra, análise a jusante, e assim por diante. Muitos cientistas começam com manchas de sangue secas (DBS) e assim como extrair DNA de tais amostras é de particular interesse. Um DBS é comumente preparado, coletando sangue em um Whatman FTA card2 ou Whatman cromatográfico de 3 mm de papel filtro, e deixando-o secar por um período de tempo (~4 horas) antes do processamento. Este método de bio-amostragem é utilizado há décadas.

um método útil para isolar o ADN dessas amostras utilizando o BT Chelex 100 Resin3 é descrito abaixo.

Passo 1: lise eritrocitária

• cortar uma mancha de sangue seca e colocá-la num tubo de microcentrifugação (1, 5 ml) usando um perfurador de buracos. Não se esqueça de rotular o tubo, especialmente quando trabalhar em várias amostras. Para efeitos de controlo de Qualidade, incluir também uma mancha de sangue de controlo positivo.
• adicionar 1 ml de 0, 5% de saponina ao tubo de microcentrifugação contendo a mancha de sangue. Fechar, vórtice, e incubar a 4 0C durante pelo menos 4 horas, ou melhor ainda, durante a noite. Nesta etapa, complexos de saponina com colesterol na membrana eritrocitária levando à formação de poros na membrana e, portanto, hemólise.4 saponina é um reagente de lise comumente usado na libertação de parasitas (por exemplo, parasitas da malária) dos glóbulos vermelhos.
• rodar durante alguns segundos a 4.000 rpm, para remover gotas da tampa interior e aspirar a saponina do tubo utilizando uma ponta de pipeta não-barreira ligada a uma pipeta pasteur numa máquina de montagem de vácuo. Também pode ser utilizada uma pipeta pasteur de plástico. Deixe o local no tubo de microcentrifugação.

segunda etapa: Lavagem

• adicionar 1 ml de solução salina tamponada de fosfato ao microcentrifugador, fechar, vórtice e incubar a 4 0C durante 20 a 30 minutos. Incubar durante a noite não vai causar nenhum mal. Este passo garante que a saponina é removida do tubo.
• girar por alguns segundos a 4.000 rpm, e depois remover o PBS, da mesma forma que removeu a saponina. Deixe o local no tubo de microcentrifugação.

terceira fase: extracção do ADN com resina Quelex

princípio: a resina Quelex actua impedindo a degradação do ADN a partir de enzimas degradantes (DNases) e de potenciais contaminantes que possam inibir as análises a jusante. Em geral, a resina Quelex irá capturar esses contaminantes, deixando o ADN em solução. A resina de Chelex prende catiões como o Mg2+, um importante co-fator para a ação da DNase, protegendo assim o DNA da degradação.5,6

• Pipetar e adicionar 150 µl de solução de resina Quelex a 6, 7% no tubo de microcentrifugação que contém a mancha. Fecha o tubo. Um lembrete importante: ao preparar a solução de 6,7% de Quelex, use água que está livre de DNases, nucleases (ou qualquer coisa que possa prejudicar e degradar o DNA).
• incubar a 95 0C durante 10 minutos utilizando um bloco de calor / agitador. É importante abrir o tubo duas vezes, a cada 2 minutos, para libertar a pressão, e depois agitar durante alguns segundos. Isto liberta ADN em solução.

Passo Quatro: Evitar a Resina Chelex Contas Final, Extrato

• Rotação para a 5 minutos a 4.000 rpm
• Pipeta como muito extrair possível em um pequeno tubo de microcentrífuga (0,6 ml), utilizando um aerossol barreira de ponta, evitando a transferência de Chelex esferas.
• centrifugar o microcentrifugador de 0,6 ml a 4.000 rpm durante 10 minutos. A idéia do segundo giro é remover quaisquer contas Quelex remanescentes que possam transitar para o extrato final. Porque é que isto é importante? Duas razões principais: 1) o Quelex liga-se aos iões de magnésio (co-factor essencial para a Taq polimerase utilizada na PCR) e 2) Quelex fluoresces. Se fluorescência é a sua maneira de visualizar um resultado, isso pode criar um falso positivo.Pipetar aproximadamente 100 µL e transferir o extracto final para um novo microcentrifugador. Rótulo e conservar no frigorífico.

Algumas Dicas ao Fazer Extrações de DNA

• Trabalhar em um ambiente limpo, livre de contaminantes
• Utilizar pontas de pipetas que são livre de nucleases
• Alça de todas as amostras com luvas
• Novamente, evitar Chelex contas no final extrair

Conclusão

Chelex resin7, fornece um simples, e rápido método de extração de DNA a partir de DBS, para uso em várias molecular aplicações analíticas. Este método não requer equipamentos caros e é confiável quando testado contra outros métodos.

1. GE Healthcare (2010). Extracção fiável de ADN dos cartões Whatman FTA. Nota de Aplicação 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, UK: GE Healthcare.
2. Whatman (N. D.). A preparar um disco FTA para análise de ADN. Protocolo de Whatman FTA BD08.
3. Bio-Rad (N. D.) Chelex® 100 e Chelex 20 quelante Manual De Instruções Em Resina de permuta iónica. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). A hemólise dos eritrócitos humanos com saponina afecta a estrutura da membrana. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Protocolo De Extracção: Chelex. Site da IBRC. Retrieved from http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (N. D.). Desenvolvimento e validação interna de um protocolo de extracção de ADN Chelex ® para esfregaços orais de referência.Walsh, P. S., Metzger, D. A., e Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing from Forensic Material. Biotechniques, 54 (3), 134-139.