ClpP protease de ativação resulta da reorganização da eletrostática de interação de redes na entrada poros

modo de Ligação da ACP1 para EcClpP

Para elucidar a base estrutural para ClpP de ativação por ACP128, estruturas de NmClpP e EcClpP (Fig. 1a) no complexo com análogos ACP1 foram procurados. Enquanto uma estrutura de NmClpP com acp1 ligado não foi alcançada apesar de repetidas tentativas, uma estrutura do complexo EcClpP+ACP1-06 foi determinada para 1,9 resolução Å(Fig. 1b, c, Quadro 1), contendo um tetradecâmero na unidade assimétrica (cadeias A-N). Densidade de elétrons para resíduos n-terminais que formam os loops axiais de EcClpP não é clara em todas as subunidades, exceto uma (cadeia B). Em estruturas publicadas anteriormente, estes loops axiais são altamente flexíveis e são geralmente desordenados no cristal na ausência de ativadores ou através da preclusão por pacotes de cristal23. Densidade de elétrons sem ambiguidade foi observada para uma única molécula ACP1-06 em um bolso formado por subunidades D E E, mostrando duas configurações diferentes do composto (Fig. 2a, b). Ambas as configurações foram modeladas na densidade de elétrons, em que a primeira configuração posiciona a porção trifluorometilpiridina do composto dentro de uma bolsa hidrofóbica (configuração para baixo), enquanto a segunda posiciona-a fora da Bolsa hidrofóbica exposta ao solvente (configuração para cima) (Fig. 2a). Os restantes 13 bolsões hidrofóbicos mostram uma densidade de elétrons ambígua para ACP1-06. Modelamos e refinamos todas as 14 moléculas ACP1-06 em configurações para cima e para baixo na ocupação de 0,5, resultando em densidade de elétrons melhorada para cada ligante.

os modos de ligação do ACP1-06 (Fig. 2b-d) aproximar os níveis de apitos observados em estruturas cristalinas de diferentes ClpPs bacterianos(Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Note que os compostos sintetizados por nosso grupo são numerados como ACP1-YY e ADEP-YY, enquanto compostos de estudos por outros grupos são nomeados como nos respectivos artigos publicados. Todas as proteínas contatos com ACP1-06 são apolar na natureza, exceto por duas notáveis eletrostática obrigações que ocorrem entre (1) a hidroxila fenólica cadeia lateral de Y76 e a amida de oxigênio da ACP1-06, e (2) o guanidinyl cadeia lateral de R206 (o penúltimo Arg em EcClpP) e um sulfonil oxigênio da ACP1-06 (Fig. 2b). As duas últimas interações estão presentes em ambas as configurações do ACP1-06. In addition, R206 (Chain E) is stabilized by ionic bonding with E65 of an adjacent subunit (Chain D) (Fig. 3a, b).

Na configuração, o trifluoromethylpyridine metade da ACP1-06 ocupa uma cavidade hidrofóbica formada por L62, T93, e F96 (Cadeia), D), e Y74, Y76, I104, L203, e L 128 Cadeia (E) (Figs. 2b e 3b). Esta é a mesma cavidade ocupada pelo anel do resíduo de Phe exocíclico dos diferentes análogos de ADEP cocristalizados com ClpP, como em nosso NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) ou a EcClpP+ADEP1 structures40 (Fig. 2c, d). Em contraste, na configuração up, a fracção trifluorometilpiridina é Rodada em torno da ligação C–S e é solvente exposto ao fazer van der Waals contatos com Y74, I104, F126, e L203 (cadeia e) (figos. 2b e 3b). A fracção gem-dimetil empilhava-se contra o anel plano de Y74 (cadeia e), enquanto a cadeia alifática estendida terminava com um anel de fenilo Orto-cloro-substituído, se encontrava numa ranhura não-polar entre duas hélices de subunidades adjacentes (Fig. 3b). Essa ligação fenda é formada por L62 Cadeia (D), F63 Cadeia (D), A66 (Cadeia), D), L37 Cadeia (E), V42 Cadeia (E), e a parte apolar do E40 Cadeia (E) (Figs. 2b e 3b).

Em ambos os ACP1-06 – e ADEP1 ligados a estruturas de EcClpP, o intrasubunit sal ponte entre R36 e E40 é encontrado, onde a vizinha alifáticos cauda de ADEP1 ou o cloro-fenil substituído anel de ACP1-06 formas hidrofóbico interação com a cadeia lateral de E40 (Fig. 3b, c). Os dois ativadores estão ainda mais estabilizados no local hidrofóbico por dois padrões distintos de ligação de hidrogênio. Enquanto ACP1-06 é fixado através de uma interação iônica exposta ao solvente entre o seu grupo sulfonil e o resíduo R206 C-terminal (Fig. 3b), o ADEP1 é mantido no lugar por duas ligações de hidrogênio com o grupo hidroxilo de Y76 isolado dentro do local hidrofóbico(Fig. 3c). Uma ligação de hidrogênio mediada por solvente entre E65 e o grupo carbonil da cadeia lateral N-acil FHE de ADEP1 fortalece ainda mais sua interação com EcClpP (Fig. 3c). Este extra de ligação de hidrogênio, bem como o tamanho maior do cíclica depsipeptide anel, que tem mais área de superfície com a qual o formulário de van der Waals interacções, em comparação com o menor trifluoromethylpyridine grupo de ACP1, pode explicar o geralmente mais apertado vinculação observada para ADEPs que ACP1s28.

In The EcClpP+ACP1-06 structure, we found an unexplained electron density in all 14 subunits extending from the nucleophilic residue S111 of the catalytic triad, suggesting a covalent modification(Supplementary Fig. 1a, b). A densidade estende-se em ângulos aproximadamente rectos em direções opostas longe das cadeias laterais S111. Apesar de grandes esforços, não podia ser equipado de forma convincente com peptídeos, acilcetona ou várias moléculas conhecidas de inibidores da protease da serina.

Modo De Ligação do ADEP ao NmClpP

NmClpP tem uma pro-sequência mais Curta no n-terminus, enquanto tem quatro resíduos extra no C-terminus em comparação com EcClpP(Fig. 1a). Embora o NmClpP tenha sido expresso como uma proteína de comprimento total transportando um His6-tag N-terminal, observamos repetidamente falta de ligação à resina de ácido Ni-nitrilotriacético. A sequenciação N-terminal da proteína purificada revelou que o NmClpP Maduro começa no resíduo Y6 (Fig. 1a), indicando autoproteólise para libertar a sua pro-sequência N-terminal (1MSFDN5).Anteriormente, tínhamos determinado a estrutura do NmClpP com o ADEP-0419. Neste estudo, determinamos a estrutura de apo-NmClpP a 2.0 Å e NmClpP com ADEP-14 a 2.7 Å (Fig. 1b, c, Suplemento Fig. 1c, Quadro 1). A estrutura de apo-NmClpP contém um tetradecamer na unidade assimétrica e não mostra densidade clara para qualquer um dos 14 loops axiais N-terminal. A fraca densidade de elétrons é observada para os loops formados por resíduos G133-G137 na área β8 da região do cabo (Fig. 1a). A unidade assimétrica para o cristal NmClpP+ADEP-14 contém dois tetradecamers (figura suplementar. 1d). Não foi observada densidade de elétrons para resíduos de 1-22 de todas as 28 subunidades devido ao empacotamento de cristais (Fig. 1C, Suplemento Fig. 1d). Além disso,a cadeia β8 (resíduos 130-137; Fig. 1a) é apenas parcialmente visível em todas as subunidades. O ADEP-14 Está ligado ao NmClpP em uma configuração semelhante ao ADEP-04 (figos. 2e, f e 3e, f). Brevemente, o difluorophenyl metade da ADEP-14 ocupa um bolso hidrofóbico formado por Y67, L95, L97, e L119 de uma subunidade, e V49, L53, T84, e F87 de um adjacentes subunidade (Fig. 3e). O anel com seis membros da fracção do ácido pipecólico é exposto com solvente e estabilizado pelo anel fenil de F117 e pelas cadeias laterais hidrofóbicas de L97, L119 e L196 (Fig. 3e). The additional methyl substitution on the allo-threonine residue of the depsipeptide ring(Fig. 1b) é exposto ao solvente. Como o ADEP-04, O ADEP-14 é garantido no bolso hidrofóbico altamente complementar por duas interações de ligação de hidrogênio entre o grupo fenólico hidroxila de Y67, o grupo amino do resíduo de difluorofenilalanina, e o grupo alanina carbonila no anel depsipeptídeo, e uma ligação de hidrogênio mediada por solvente com E56(Fig. 3e, f). A cadeia lateral do ácido octadienóico de ADEP-14 está localizada no canal hidrofóbico estreito formado por L53, F54 e S57 de uma subunidade, e R27, L28, E31, I33, F35 e Y67 da subunidade vizinha (Fig. 3e).

ACP1 – and ADEP-binding result in distinct allosteric effects on the ClpP barrel

Using structures of apo-and compound-bound forms of EcClpP and NmClpP(Fig. 1c), analisamos os efeitos alostéricos que ocorrem sobre a ligação do activador. Como indicado na figura complementar. 2, activator binding acts as a wedge causing the lateral displacement of two adjacent subunits. A extensão da mudança conformacional global causada pela ligação ACP1-06 (rmsd = 0.84 Å em relação à apo-EcClpP) é semelhante à do ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å em relação à apo-NmClpP), mas menos do que a APO-NmClpP (rmsd = 2,47 Å em relação à apo-NmClpP). Curiosamente, a direção do deslocamento é diferente entre as duas classes de ativadores (figura suplementar. 2 and Supplementary Movies 1-4). Entre os dois ADEPs, o ADEP-14 causa uma maior perturbação estrutural geral para o cilindro NmClpP (comparar Filmes suplementares 3 vs. 4). ADEP-binding resulta em uma expansão da superfície apical de NmClpP acompanhada por constrição na região equatorial. O pivô para este movimento está na região do punho composta de helix aE e strand β8. Este fenômeno é observado em todas as estruturas ClpP ligadas ao ADEP conhecidas até à data,com vários graus de compactação do Cilíndrico ClpP 15,18,19,23, 40. Em contraste, ACP1-06 ligando-se a EcClpP causa um movimento interno de todas as subunidades, resultando em aperto do cilindro ClpP (filme suplementar 1). Assim, as estruturas mostram que ACP1s e ADEPs ativam ClpP induzindo efeitos alostéricos distintos.

In the activator-bound EcClpP and NmClpP structures, the ring–ring interface electrostatic bonds that stabilize the tetradecamer remain conserved despite the conformational changes (Supplementary Fig. 3). Além disso, apesar da mudança estrutural global sobre a ligação do ativador, as tríades catalíticas Ser-His-Asp de EcClpP e NmClpP mantêm geometrias cataliticamente competentes como apenas pequenas mudanças de coluna da Ca ocorrem perto do local ativo (Supplementary Fig. 1a-c). A análise de todas as estruturas existentes ACP1-e ADEP-ligadas do ClpP mostra que a ligação composta também resulta na contração da região equatorial (Figo suplementar. 4).Quantificámos a compactação do cilindro ClpP sobre a ligação ACP1 ou ADEP, medindo os volumes das respectivas câmaras catalíticas (Fig. suplementar. 4). A ligação ACP1-06 causa uma diminuição de ~5% no volume da Câmara catalítica em relação a apo-EcClpP. ADEP1-binding to EcClpP results in a similar decrease in catalytic chamber volume. This is also observed for other activator-bound ClpP structures such as ADEP-14-bound NmClpP, ADEP-bound BsClpP, and the ADEP-bound MtClpP1P2 heterooligomeric complex(Supplementary Fig. 4).

clpp activation results in the reorganization of the electrostatic bonding network at the axial pores

In the structure of apo-NmClpP, two electrostatic bonds near the axial pore stabilize the interface of any two adjacent subunits(Fig. 3d, suplementar Fig. 5). Primeiro, o grupo carboxilato de E58 carregado negativamente de uma subunidade forma um par iônico com o grupo guanidínio R27 carregado positivamente da subunidade adjacente. Em segundo lugar, os grupos S57 hidroxil e E31 carboxilato de duas subunidades adjacentes formam uma ligação de hidrogênio. Após a ligação de ADEP, estas duas ligações não-convovalentes quebram, enquanto a ligação iônica entre R27 e E31 da mesma subunidade é encurtada, ou seja, fortalecida (Fig. 3e, f). In apo-EcClpP, only one ionic bond between E67 and R36 links two adjacent subunits, since the equivalent residue to S57 of NmClpP is an alanine in EcClpP and is thus unable to form a hydrogen bond with E40(Fig. 3a). Como em NmClpP, a ligação de ACP1 ou ADEP1 para EcClpP elimina a ligação iônica intersubunita E67-R36 e dá origem a uma ligação iônica intrasubunita mais forte entre R36 e E40(Fig. 3b, c, Figo suplementar. 5).

para verificar ainda mais essas observações, projetamos mutantes NmClpP e EcClpP point que levam à perda das ligações eletrostáticas intersubunitas acima. Como mostrado na Fig. 4a, while WT NmClpP was unable to degrade the protein caseínas, the NmClpP e58a mutant was found to degrade caseína at a higher rate than the e31a mutant. Mais importante, o mutante duplo e31a + E58A tinha uma atividade ainda maior do que os mutantes únicos. A extensão da ativação do NmClpP mutante duplo é semelhante à observada na presença de 1 µM ADEPs ou 10 µM ACP1s (Fig. 4a). Comportamento semelhante foi observado para EcClpP com mutações semelhantes (E40a e E67A; Fig. 4b). O respectivo mutante Duplo EcClpP não é solúvel e não pôde ser testado.

Posteriormente, determinou-X-ray estruturas de NmClpP E58A e NmClpP E31A + E58A mutantes (Tabela 1). Os pontos catalíticos em ambos os mutantes não são perturbados (Fig. complementar. 1e). In the NmClpP E58A single mutant, the mutation abolishes the intersubunit E58-R27 ionic bond and gives rise to a stronger intrasubunit R27-E31 interaction, while the hydrogen bond between S57 and E31 remains (Fig. 4c). Um “efeito wedge” similar é observado na estrutura, como mostrado pela mudança conformacional global sutil na coluna vertebral da AC do mutante NmClpP (rmsd = 0.33 Å em relação ao WT NmClpP) (Supplementary Movie 5). Mutação de ambos E31 e E58 da alanina para gerar o duplo mutante NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0.29 Å em relação à WT NmClpP) suprime os dois estabilização intersubunit eletrostática medicamentosas, bem como, o intrasubunit R27–E31 iônica bond presente no NmClpP E58A único mutante (Fig. 4D e filme suplementar 6) e em NmClpP (Fig. 3e, f). Assim, o NmClpP E31a + E58a mutante duplo é diferente do NmClpP ligado a ADEP com a ligação iónica intrasubunita eliminada, mas é, no entanto, uma proteína activada com actividade proteolítica intrínseca comparável à do ClpP activado por moléculas pequenas (Fig. 4a). Tal como o NmClpP ligado a ADEP, tanto o NmClpP simples como o duplo mutante reduziram os volumes da Câmara catalítica devido à compactação do barril ClpP (Fig suplementar. 4).

tal reorganização da rede de ligação é observada para todas as estruturas ClpP activadas disponíveis no PDB, quer na presença de activadores de moléculas pequenas ou devido a mutações específicas (Fig. suplementar. 6). Por exemplo, em pequena molécula ativador de ligação para B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), o M. tuberculosis ClpP (MtClpP), e o Homo sapiens ClpP (HsClpP) suprime um ou dois intersubunit eletrostática títulos de perto o axial de poros, e dá origem a uma mais forte, intrasubunit interação iônica (Complementar Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. No MtClpP2, a ligação iónica intersubunita equivalente à interacção E58–R27 no NmClpP não existe 18. O equivalente de resíduos para E58 de NmClpP é C66 em MtClpP2 e é incapaz de participar de uma interação iônica com K35 de MtClpP2 (equivalente a R27 de NmClpP). Em vez disso, uma ligação intersubunit de hidrogênio entre S65 e E39 estabiliza a interface (figura suplementar. 6g, h). A ligação de ADEP ao MtClpP2 quebra a ligação de hidrogênio S65–E39 e fortalece a ligação iônica intrasubunita entre K35 e E3918.

Curiosamente, mesmo ativado SaClpP Y63A variant41, com a ativação de mutação encontrada no centro da hidrofóbica do site, e, portanto, não é equivalente ao mutações ativadoras do NmClpP aqui apresentados, que apoia a nossa proposta de modelo de reorganização de hidrogênio a ligação de rede ao redor do axial de poros após a ClpP de ativação (Complementar Fig. 6f). Na estrutura do SaClpP Y63A mutante, a distância entre o intersubunit de iões de par (Q54–R23) é aumentada, enquanto a intrasubunit sal ponte (R23–D27) é reforçada (Complementar Fig. 6d, f). Também geramos a mutação Y63A equivalente em EcClpP e NmClpP. O mutante NmClpP Y67A foi insolúvel, enquanto o EcClpP Y76A tinha uma atividade ligeiramente maior que o mutante E40A, mas menor que o mutante E67A (Fig. 4b).

ClpP de ativação resulta em redução na heterogeneidade estrutural do N-terminal axial loops

Como discutido acima, no ordenou axial ciclo do NmClpP+ADEP-04 complexo formando o β1–β2 curva fechada, ADEP ligação lançamentos R27 a partir de um intersubunit iônica ligação com E58 e fortalece o intrasubunit iônica ligação com E31 de hélice aA (Fig. 5a). Consequentemente, R27 forma uma ligação iônica com D23 da cadeia β1 do laço axial. Esta interação estabilizadora é observada em todas as estruturas ligadas ao ativador do ClpP onde os loops axiais são ordenados (Fig. 5a-e).

Para o EcClpP+ACP1-06 estrutura, o axial de loops (resíduos 14-31) são parcialmente ordenados em cristal com apenas 1 fora de 14 axial loops, formando o β1–β2 curva fechada (Fig. 1c-a encomenda completa parece ser parcialmente impedida por efeitos de embalagem cristalina). No laço axial ordenado da subunidade A, a liberação de R36 da ligação iônica intersubunit com E67 permite que ela forme uma ligação iônica intrasubunit mais forte com E40 da helix aA(Fig. 5f). No entanto, não há interação iônica estabilizadora entre E22 da cadeia β1 e R36 da helix aA, provavelmente devido à ordenação parcial (Fig. 5f). Uma ligação adicional de hidrogênio entre D32 da cadeia β2 e S21 da helix aA ancora o laço axial para o domínio do núcleo EcClpP(Fig. 5f). Da mesma forma, os loops axiais na estrutura Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 são apenas parcialmente ordered21. O conservado de ligação de hidrogênio entre o Arg resíduo de hélice aA e uma carga negativa resíduo da vertente β1 não é visto parcialmente ordenado EfClpP axial loops, embora EfClpP tem potencial de ligação de hidrogênio formando resíduos na vertente β1 (T6), e no loop de conectar fios de β1 e β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

In addition to conserved electrostatic interactions, extensive hydrophobic contacts with the ClpP head domain stabilize the axial loops. Em EcClpP+ACP1-06, apolar N-terminal de resíduos da vertente β1 e o anterior estruturado bobina de participar de interações hidrofóbicas com apolar resíduos de hélice aA da mesma subunidade, e sobre o nível de rostos de hélices, aA e aB’ de um vizinho subunidade (Complementar Fig. 7a). Os resíduos não-polares nas hélices aA, aB’ e β3′ constituem um sistema hidrofóbico contínuo na circunferência do poro axial (Figo suplementar. 7b) 15.

To get a clearly picture of the conformational heterogeneity of the ClpP axial loops, methyl-TROSY NMR experiments were then carried out. Inicialmente, uma única mutação de cisteína foi introduzida nos loops axiais de NmClpP(T10C). A proteína uniformemente deuterizada foi produzida e subsequentemente reagiu com 13C-metil-metanotiossulfonato (MMTS). Isto resulta na fixação de um único grupo NMR visível 13CH3–S à cadeia lateral de cisteína, levando à formação de um resíduo s-metiltio-cisteína (MTC) 42. Este método fornece uma maneira fácil de monitorar a estrutura e dinâmica de grandes complexos em solução. A monitorização das correlações NMR da sonda ligada ao spin em formas livres, ligadas ao activador ou mutadas da enzima fornece uma leitura da conformação da solução dos poros axiais.Inicialmente, foram realizados experimentos de controle para garantir que a introdução da fracção T10MTC não perturba a estrutura do NmClpP. Brevemente, 1H–13C heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC) correlações de WT e T10MTC NmClpP rotulado 13CH3 na cadeia lateral de ILVM resíduos em um outro totalmente deuterated de fundo foram comparados e encontrado para ser virtualmente idênticas. Subsequentemente, as correlações HMQC–1H-13C do NmClpP T10MTC foram obtidas em diferentes estados(Fig. 6a). A forma apo (contornos azuis) tem um grande número de correlações, indicando laços axiais estruturalmente heterogêneos. Adição de excesso molar duplo de ADEP-28(actividade indicada na Fig. 4a) sobre ClpP monoméricas reduziu significativamente o número de correlações (contornos vermelhos), indicando rigidez ou ordenação estrutural. Em contraste, a ligação ACP1-17 (excesso molar duas vezes superior ao ClpP monomérico; actividade indicada na Fig. 4a) resulta em alterações indetectáveis nas correlações observadas (contornos verdes), implicando que os laços axiais não são afetados.

esta abordagem foi também explorada para monitorizar o efeito de activação das mutações(Fig. 4a, b) nos laços axiais. Nestes experimentos, as mutações de ativação foram introduzidas no fundo da mutação T10C (rotulagem). Como mostrado na Fig. 6a, as correlações do NmClpP T10MTC/e31a mutante (contornos vermelhos) são ligeiramente menos heterogéneas do que a pseudo forma WT, enquanto as do NmClpP T10MTC/e58a mutante (contornos laranja) são praticamente inalteradas. A presença simultânea de ambas as mutações ativadoras (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) tem muito efeito mais dramático do que uma única mutações e remove um grande número de correlações correspondentes ao eixo de loops (preto contornos). Isto é consistente com a observação de que o mutante duplo é mais activo do que os mutantes isolados (Fig. 4a).

clpp activation results in reduction in conformational heterogeneity of the handle region

The same NMR-based approach was used to probe the effect of activator binding and mutations on the handle region. Um mutante de NmClpP i144mtc (helix aE) foi preparado e estudado pela NMR nas formas apo-, ADEP-28 e ACP1-17. A forma apo (contornos azuis, Fig. 6a) exibe um par de picos, indicando que a região do cabo está associada a um par de conformações coexistentes, como visto em nosso trabalho anterior no Ecclp4. Curiosamente, a adição de ACP1 e ADEP leva ao desaparecimento de um dos picos. Dado que o local de ligação do activador é distal à sonda de spin NMR, parece que ACP1 ou ADEP ligando alostericamente seleciona para uma das conformações na região do cabo. Alternativamente, os ativadores podem ser capazes de ligar ambas as formas, mas induzir uma mudança para um único estado.Experiências de troca de magnetização com períodos de tempo de mistura de 100, 200, 300, 400, 500, e 600 ms a 40 ° C foram incapazes de detectar qualquer interconversão entre os conformadores observados para a região do punho para WT NmClpP. Isto indica que o processo de troca é muito lento para a caracterização por NMR.SAXS demonstra mudanças conformacionais de ClpP induzidas pelo ativador na solução

para sondar o estado oligomérico e mudanças estruturais sobre a ligação de compostos, amostras de apo-NmClpP e NmClpP+ADEP-04 foram caracterizadas por SAXS (Fig. 6b-g e Figo suplementar. 8). As curvas finais fundidas são mostradas na figura. 6b, e os perfis de SAXS obtidos assemelhavam-se aos das estruturas ocas43. Não foram encontradas alterações significativas em termos de dobragem global (Figo suplementar. 8), raio de giração (Rg) e estado oligomérico quando ADEP-04 foi adicionado ao NmClpP (Supplementary Fig. 8c). A fim de analisar ainda mais os perfis NmClpP SAXS e gerar soluções ab estruturas initio, o programa GNOM foi usado para construir funções de distribuição de distância par, p(r). Apo-NmClpP p (r) revelou um deslocamento sutil para a direita e maior dimensão máxima (Dmax) em comparação com ADEP-04-bound NmClpP (Fig. 6c e Figo suplementar. 8c). Subsequentemente, modelos de átomos fictícios (barragens) foram gerados usando dados de SAXS para analisar visualmente estruturas de solução NmClpP (Fig. 6d-g). Dez modelos foram gerados para APO-NmClpP e ADEP-04-bound NmClpP, e os mais prováveis foram escolhidos. Estes modelos mostraram que, em geral, as duas estruturas de solução NmClpP são similares (cilindros ocos). No entanto, quando sobrepostas com as estruturas cristalinas correspondentes, diferenças que concordam com as estruturas de alta resolução foram facilmente observadas(Fig. 6d, e). Uma medida das alturas axiais de todas as dez barragens para o NmClpP ligado a apo e ADEP – 04 resultou em valores de 93,0 ± 5,4 Å para a forma apo e 103,5 ± 6,1 Å para a forma ligada a ADEP-04. Para corroborar ainda mais esta observação, A Média dos mapas de probabilidade das barragens e dos mapas de ocupação mais elevados DAs (Fig. 6f, g) foram analisados. As alturas axiais apresentaram um aumento de cerca de 10 Å para o NmClpP ligado ao ADEP-04 em comparação com o apo-NmClpP. Além disso, ADEP-04-bound NmClpP mostrou uma circunferência axial poro maior do que apo-NmClpP (Fig. 6f, g). Assim, apesar da baixa resolução da técnica de SAXS, os resultados sugerem que a ADEP-04 de ligação para NmClpP não afeta as procianidinas estado de NmClpP, mas causa uma expansão do axial poros e aumento da ocupação nas partes superior e inferior do NmClpP+ADEP-04 BARRAGEM (Fig. 6e, g) em comparação com a apo-NmClpP. Isto provavelmente reflete as mudanças conformacionais que levaram à diminuição da heterogeneidade da estrutura dos laços axiais n-terminais de NmClpP observados por raios X e NMR.