Clonal de hematopoiese em pacientes com anticorpos citoplasmáticos anti-neutrófilos associada a vasculite| Haematologica

Clonal de hematopoiese indeterminado potencial (CHIP) – definido pela presença de um somáticas hematológica associada a câncer de mutação genética com um alelo variante freqüência ≥2% – ocorre no sangue periférico de, pelo menos, 10% dos indivíduos com mais de 60 anos de idade, sem qualquer história de um hematológicas transtorno.21 As mutações afectam principalmente os reguladores epigenéticos da transcrição DNMT3A, TET2 e ASXL1, levando a uma vantagem competitiva das células estaminais hematopoiéticas mutadas com um subsequente viés diferenciado em relação ao compartimento mielóide.A frequência do CHIP aumenta com a idade e associa-se com maior risco de desenvolver doenças malignas hematológicas e cardiovasculares, levando ao aumento da mortalidade global.5

usando um modelo de rato com macrófagos deficientes em Tet2, foi demonstrado que a aterosclerose e a doença coronária são impulsionadas pelo CHIP através de uma função inflamassoma alterada, levando a níveis aumentados de citoquinas pró-inflamatórias.O nosso grupo detectou recentemente uma correlação entre mutações DNMT3A e doença crônica enxerto-versus-hospedeiro, fornecendo mais evidências de um importante papel do CHIP em reações inflamatórias crônicas.7 no entanto, pouco se sabe sobre o papel do CHIP em doenças auto-imunes. Um estudo em 56 doentes com artrite reumatóide não mostrou qualquer correlação do CHIP com a actividade da doença.As vasculites auto-imunes associadas ao anticorpo citoplasmático anti-neutrófilos (ANCA) incluem uma variedade de vasculites necrotizantes, incluindo granulomatose com poliangiite e poliangiite microscópica, e são caracterizadas por uma inflamação grave dos vasos, potencialmente afetando todos os sistemas de órgãos. A ANCA é dirigida contra a autoantigens mieloperoxidase (MPO) e a proteinase 3 (PR3). Ao ligarem-se aos antigénios expressos na superfície celular, a IgG da ANCA provoca a activação descontrolada de neutrófilos e monócitos, conduzindo a danos endoteliais e falência do órgão final. Na maioria dos indivíduos, a maior carga de mutação do CHIP pode ser encontrada em células mielóides,4 que são as únicas células de resposta primária com expressão de autoantigeno no AAV. Além disso, TET2 e DNMT3A desempenham um papel central no silenciamento de genes através da regulação da metilação do ADN. De facto, foi notificado um silenciamento genético defeituoso em células mielóides de doentes com AV. Este processo desregulado incluiu os autoantigenos ANCA e correlacionou-se com o risco de recaída.119

em resumo, os dados recentes apoiam a ideia de potenciais ligações, no que diz respeito à patogénese e aos resultados clínicos, entre o CHIP e as doenças auto-imunes/condições inflamatórias. Portanto, caracterizamos CHIP em uma grande coorte de pacientes com AV, examinando prevalência, mudanças dinâmicas ao longo do tempo, manifestações orgânicas, silenciamento antígeno ANCA, e ativação in vitro induzida ANCA.

recolhemos amostras de sangue periférico de doentes com AAV, observados nos departamentos e enfermarias de Nefrologia de Charité/HELIOS (Berlim, Alemanha, entre abril de 2005 e outubro de 2018). Os dados demográficos e clínicos dos pacientes foram extraídos de seus registros médicos. Todos os pacientes deram seu consentimento informado por escrito para a inclusão no estudo, que foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. A aprovação ética foi obtida dos comitês de ética locais.

o ADN do sangue total foi rastreado para CHIP usando uma versão personalizada do Painel de sequenciação mielóide ilumina TruSight (tabela suplementar Online S1) em um sequenciador NextSeq. A análise de sequenciamento foi realizada usando um hub de sequenciamento de plataforma Illumina BaseSpace. Apenas variantes não sinónimas com frequências alélicas ≥2% foram incluídas. As variantes candidatas foram validadas por sequenciação profunda orientada (métodos suplementares Online). Um total de 46 mutações somáticas foram identificadas em 34 de 112 doentes com AV (30, 4%) com uma mediana da frequência do alelo variante de 5.2% (Quadro Suplementar Em Linha S2). Enquanto 25 pacientes tiveram uma única mutação, oito tiveram dois, e um paciente teve cinco. Os genes com mutações mais frequentes foram DNMT3A (19/46=39,1%), TET2 (7/46=15,2%) e ASXL1 (4/46=8,7%) (figura 1A). Entre as 46 mutações, 26 foram missense, 18 foram truncantes e duas foram mutações no local de fusão. A mudança de base mais frequente nas mutações missense foi C > T (16/30) (figura suplementar Online S1).

Comparado relatado anteriormente, as prevalências de CHIP em desmarcada controle de coortes de idade semelhante e tecnologia de sequenciamento,15128743 o CHIP de prevalência do vírus adeno-associados pacientes foi significativamente maior (de 30,4% em relação a 13,5%, P<0,001) (Figura 1C On-line Quadro Suplementar e S3). Tendo em mente as diferentes tecnologias de sequenciamento utilizados nestes estudos, foram investigados a idade e o sexo-controle pareado coorte de 112 indivíduos saudáveis, entre os quais 22 mutações foram encontradas em 20 indivíduos (controles saudáveis vs. AAV pacientes: 17.9% vs. 30,4% e P=0.042) (Quadro Suplementar Em Linha S4, Números Suplementares Em Linha S2-S4). De notar, encontramos uma proporção relevante de pacientes com vea com CHIP com idade ≤55 anos (6/33=18,2%) (figura 1B). Estavam disponíveis amostras de acompanhamento do sangue periférico para 19 doentes com AV do CHIP. A mediana do seguimento foi de 2, 3 anos (intervalo de 0, 3-10, 9 anos). A carga mutacional das amostras de série destes 19 pacientes em dois a quatro pontos temporais foi quantificada por sequenciação profunda.171674 enquanto cinco doentes apresentaram um aumento relevante no tamanho dos clones, dois doentes apresentaram clones ligeiramente decrescentes e 12 doentes não apresentaram alterações no tamanho dos clones ao longo do tempo (figura 1D, figura suplementar Online S5). Em seguida, investigamos uma amostra de acompanhamento de cada um dos 20 pacientes com chips, coletados 2 a 10 anos após a amostra inicial. Nenhuma das 20 amostras de acompanhamento mostrou uma nova mutação.Foram realizadas análises estatísticas exploratórias

para identificar associações entre o CHIP e os parâmetros clínicos (76 doentes com granulomatose com poliangiite e 34 com poliangiite microscópica). Os doentes com CHIP foram significativamente mais velhos do que os doentes com CHIP (mediana 70, 5 vs. 63, 0 anos, respectivamente, P=0, 017). A prevalência do CHIP não foi superior entre os doentes que tinham recebido tratamento imunossupressor antes da amostragem (100% esteróides, 90% ciclofosfamida, 20% rituximab, 16% azatioprina, 13% metotrexato). Não foram observadas diferenças nas contagens sanguíneas, largura de distribuição dos glóbulos vermelhos, níveis de creatinina, co-morbilidades, desenvolvimento de doenças malignas, estado de actividade da doença e risco de recidiva de AV no que respeita ao estado do CHIP. No entanto, os padrões de manifestação da doença diferiam: pacientes com CHIP afetados pela granulomatose com poliangiite mostraram menos doença renal (68, 2% vs. 88, 5%, P=0, 049) e envolvimento do sistema nervoso (0% vs. 19, 2%, P=0, 028) (tabelas suplementares Online S5-S8, números suplementares Online S6-S8).

em seguida, procurámos investigar o silenciamento do antigénio da ANCA e a activação in vitro induzida pela ANCA. Para este efeito, foram realizados ensaios in vitro de estimulação de neutrófilos utilizando oxidação da di-hidrorhodamina com anticorpos monoclonais contra os antigénios ANCA MPO e PR3 num subgrupo de doentes com AV e controlos saudáveis (métodos suplementares Online) que apresentaram resultados negativos para o CHIP. Uma redução de ativação foi observado no CHIP comparado com CHIP AAV pacientes (anti-MPO: estimulação índice: 6.29 vs. 13.01, P=0.057; anti-PR3: estimulação índice de 7.72 vs. 13.00, P=0.026) (figura 2A), enquanto que não se observaram diferenças no índice de expressão da membrana ou na percentagem de células positivas (figura 2B, C). Além disso, os níveis de mRNA no sangue periférico de PR3, MPO, CD177, RUNX3 e JMJD3 foram medidos por reacção quantitativa de polimerase em cadeia. CHIP AAV pacientes apresentaram aumento da expressão de MPO e PR3 mRNA em comparação aos níveis controles saudáveis (MPO: 1.94 vs. 0.86, P=0,026; PR3: 2.02 vs. 0.58, P=0.057), uma diferença que foi menos evidente no CHIP pacientes. No entanto, os doentes com AAV CHIP mostraram uma expressão reduzida de ARNm RUNX3 em comparação com o nível nos controlos saudáveis (0.28 vs. 0, 79, P=0, 007) (Figura 2). Devido ao pequeno número de pacientes, não fomos capazes de subdividir ainda mais os pacientes com chip AAV de acordo com os genes afetados ou as freqüências de alelos variantes e, portanto, não pudemos avaliar o seu potencial impacto em nossos achados (tabela suplementar Online S9). Adicionalmente, diferenças significativas na contagem de neutrófilos e linfócitos entre doentes com AV e controlos saudáveis podem ter afectado os nossos resultados e limitado a capacidade de tirar conclusões generalizadas (tabela suplementar Online S10).

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4%), uma prevalência significativamente mais elevada do que a notificada em coortes saudáveis e no nosso grupo de controlo combinado com a idade, mas comparável ao aumento das frequências notificadas em doentes com cancro,12 anemia18 aplástica e doenças cardiovasculares.Embora a sinalização inflamatória alterada tenha sido proposta como um mecanismo subjacente à Associação de síndromes mielodisplásicas com doenças auto-imunes/condições inflamatórias 19,um mecanismo semelhante pode ligar o CHIP com tais condições e, em particular, com AAV. A transcrição disregulada de ANCA autoantigen é comumente observada em AAV e pode ser alterada por CHIP. Curiosamente, os doentes com chip, mas não com chip AAV, apresentaram uma regulação da expressão de mRNA autoantigen que foi anteriormente relatada.119 esta descoberta bastante surpreendente sugere que a expressão do antigénio da ANCA é presumivelmente um fenómeno secundário na AAV, induzido pela sinalização inflamatória que é defeituosa nas células do CHIP. De acordo com isto, observou-se uma activação neutrófilos reduzida induzida pela ANCA em doentes com CHIP. Curiosamente, já demonstrámos anteriormente que a produção de espécies reactivas de oxigénio induzida pelo ANCA desempenha um papel importante na redução da activação dos inflamasomas por inibição oxidativa da cascata inflamasoma-caspase-1-interleucina-1β.20 a diminuição da produção de espécies reactivas de oxigénio por neutrófilos chips que encontrámos poderia, portanto, contribuir para uma activação excessiva do inflamasoma e, assim, afectar a patogénese da AAV. Clinicamente, encontramos menos manifestações renais e neuronais em pacientes com chips, sustentando a ideia de que o CHIP funciona como um modificador de doenças em AAV.

em análise longitudinal, mais de 25% dos doentes apresentaram um aumento do tamanho dos clones ao longo do tempo, sem qualquer impacto significativo de um tratamento específico na expansão dos clones. A frequência do CHIP não aumentou em doentes previamente tratados com agentes imunossupressores/citotóxicos e não enriqueceu para mutações envolvidas na resposta a danos ao ADN (tabela suplementar S11 Online). Por conseguinte, parece improvável que a elevada prevalência do CHIP seja apenas uma consequência de tratamento citotóxico e, juntamente com os tamanhos de clones em expansão, justifica uma monitorização mais apertada dos doentes com AAV afectados devido ao risco conhecido de progressão para síndromes mielodisplásicas ou leucemia mielóide aguda.1513

colectivamente, os nossos dados revelam uma nova associação de AV com CHIP com efeitos potencialmente modificadores da doença, como demonstrado para a activação de neutrófilos, regulação da transcrição autoantigena e manifestação de órgãos. Reconhecemos que, dados os múltiplos testes, os valores P não imaginam o erro do tipo I global. Estudos futuros e investigações funcionais são agora necessários para confirmar estes resultados e decifrar os mecanismos moleculares.

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