Clemizole e moduladores de serotonina sinalização suprimir crises de síndrome de Dravet

Resumo

síndrome de Dravet é uma catastrófica infância epilepsia com início precoce convulsões, atraso de linguagem e desenvolvimento motor, distúrbios do sono, ansiedade, comportamento, grave déficit cognitivo e de um aumento do risco de fatalidade. É causada principalmente por mutações de novo do gene SCN1A que codifica um canal de sódio ativado por voltagem neuronal. Os peixes-zebra com uma mutação no homólogo SCN1A recapitulam a actividade de crises espontâneas e imitam os movimentos comportamentais convulsivos observados na síndrome de Dravet. Aqui, nós mostramos que a triagem fenotípica de bibliotecas de drogas em mutantes zebrafish scn1 rapidamente e com sucesso identifica novas terapeutas. Demonstramos que o clemizol se liga aos receptores da serotonina e a sua actividade antiepiléptica pode ser imitada por fármacos que actuam nas vias de sinalização da serotonina, por exemplo, trazodona e lorcaserina. Coincidentes com estes achados de peixe-zebra, tratámos cinco doentes com síndrome de Dravet clinicamente intratável com um agonista do receptor da serotonina clinicamente aprovado (lorcaserina, Belviq®) e observámos alguns resultados promissores em termos de redução da frequência e/ou gravidade das crises. Os nossos achados demonstram um caminho rápido desde a descoberta pré-clínica em peixes-Zebra, através da identificação do alvo, até potenciais tratamentos clínicos para a síndrome de Dravet.

introdução

epilepsias de infância classificadas como catastróficas são frequentemente associadas a uma mutação genética. Entre estes, a síndrome de Dravet tem sido associada a mais de 600 mutações de novo num único gene, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). As crianças com síndrome de Dravet apresentam convulsões a partir dos 6 meses de idade, atraso no desenvolvimento da linguagem e motor, perturbações do sono, comportamento de ansiedade e grave défice cognitivo (Dravet, 2011). Foram também notificados sintomas de perturbação do espectro do autismo (Li et al., 2011) e o risco de morte súbita inexplicável com epilepsia (SUDEP) nesta população é estimado em 15 vezes maior do que outras epilepsias infantis (Kearney, 2013). Os medicamentos antiepilépticos disponíveis não oferecem um controlo adequado das crises e os procedimentos neurocirúrgicos resectivos não são normalmente uma opção. Novos tratamentos para a síndrome de Dravet continuam a ser uma necessidade importante não satisfeita, apesar de algum nível de eficácia em ensaios clínicos limitados para canabidiol (Epidiolex®) e estiripentol (Diacomit®), que podem ser associados com preocupações cognitivas ou de segurança do apetite, respectivamente (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutações no SCN1A, um gene que codifica a subunidade α-formadora de poros de um canal de sódio ligado à tensão (Nav1.1), foram identificadas em quase 85% dos doentes com síndrome de Dravet (Dravet, 2011). Os canais Nav1.1 contribuem para a despolarização rápida das membranas neuronais observadas durante a geração potencial de ação (Hodgkin et al., 1952). Ratos heterozigóticos para uma mutação de perda de função em Nav1.1 desenvolvem crises espontâneas e sensíveis à temperatura no início da vida, e morrem prematuramente por volta do dia 25 pós-natal (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Estudos de electrofisiologia aguda nestes ratinhos com deficiência de Scn1a relacionados sugerem uma redução na densidade da Corrente de sódio e uma diminuição associada na actividade de cozedura para uma subpopulação de neurónios inibitórios que expressam o GABA (mas não de células principais excitatórias), culminando numa inibição sináptica reduzida e hiperexcitabilidade da rede (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Esta hipótese de “interneuronopatia” é consistente com outras formas de epilepsias infantis catastróficas e foi confirmada em ratos onde o Scn1a foi seletivamente eliminado das subpopulações de interneuron com expressão de parvalbumina ou somatostatina (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Comportamentos autistas também foram notificados nestes ratinhos (Han et al., 2012). Curiosamente, os estudos iniciais em humanos excitatórios e inibitórios neurônios derivados usando células-tronco pluripotentes induzidas a tecnologia de dois pacientes com síndrome de Dravet relatado déficits na tensão de sódio ativado atual para ambos os tipos de células, sugerindo que ou homeostático compensação para a perda precoce da função de um crítico do cérebro específica de canal de sódio, ou outros mecanismos que contribuem para a epilepsia fenótipo observado nesses pacientes (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

Embora os ratos e humanos, células-tronco pluripotentes induzidas derivada de neurônios contribuir para a nossa compreensão da fisiopatologia subjacente de síndrome de Dravet, estes sistemas não são adequados para a rápida identificação de novas terapias devido à variabilidade destes modelos e a reprodutibilidade de medições quantitativas. Como os peixes-Zebra são um modelo ideal de vertebrados para realizar pequenos ecrãs baseados no fenótipo molecular (MacRae et al., 2015), e são passíveis de manipulações genéticas, focamos nossos esforços em um mutante canal de sódio zebrafish. Os mutantes de peixe-zebra que apresentam uma mutação missense de perda de funções no ortólogo SCN1A, scn1Lab, foram identificados numa tela de mutagénese (Schoonheim et al., 2010). Devido a uma duplicação ancestral do genoma total, os mutantes de peixe− zebra scn1Lab são haploinsuficientes para Nav1.1 e análogos ao Scn1a+/ – ratinhos ou doentes com síndrome de Dravet. Convulsiva comportamentos e episódios breves interictal e de longa duração polyspike ictal-como electrographic de descarga são observadas em mutante larvas como os primeiros 3 dias pós-fertilização (dpf) com progressão para mais robusto apreensão fenótipos entre 4 e 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). As larvas mutantes morrem prematuramente, apresentam défices metabólicos (Kumar et al., 2016), e são resistentes a muitos medicamentos antiepilépticos (AEDs) (Dinday et al., 2015). Similar ao manejo clínico da síndrome de Dravet, alguma atenuação da atividade convulsiva pode ser obtida com valproato, benzodiazepinas, brometos, estiripentol, bem como uma dieta cetogênica (Baraban et al., 2013). Usando larvas mutantes de peixe-zebra scn1Lab e uma estratégia de rastreio baseada em dois fenótipos, já rastreamos mais de 2300 compostos. Clemizol, um antagonista do receptor da histamina de primeira geração (H1), foi identificado como um potente inibidor da actividade das convulsões comportamentais e electrográficas (Baraban et al., 2013). Contudo, os anti-histamínicos estão contra-indicados em populações pediátricas epilépticas (Miyata et al., 2011) e o análogo do receptor H1 em peixes-Zebra mostra menos de 50% de semelhança com humanos (Peitsaro et al., 2007). Aqui, usamos modelos de zebra pré-clínica para demonstrar que clemizol, mas não anti-histamínicos, exercem actividade antiepiléptica. Com base na ligação dos ligandos e no rastreio adicional de drogas específicas no peixe-zebra mutante do scn1, identificámos vários moduladores de serotonina (5-HT) como eficazes na supressão de convulsões, incluindo dois compostos aprovados pela FDA (trazodona e lorcaserin). A lorcaserina (Belviq®) foi prescrita ao abrigo de um programa de uso compassivo a crianças com síndrome de Dravet e resultou numa redução da actividade de Crises em alguns doentes. Propomos que a modulação da sinalização 5-HT represente uma nova intervenção terapêutica para esta epilepsia infantil catastrófica.

Materiais e métodos

peixe-zebra manutenção

monitorização das convulsões

a 5 larvas individuais de peixe-zebra dpf foram colocadas num único poço de uma microplaca transparente de fundo plano com 96 poços contendo meio embrionário. As larvas foram selecionadas aleatoriamente, uma vez que a determinação do sexo não é possível nesta fase. Microplates were placed inside the DanioVision motion-tracking device and acclimated for 20 min at room temperature. As parcelas de locomoção foram obtidas para cada poço durante uma época de gravação de 10 minutos usando um sistema de DanioVision rodando o software EthoVision XT (DanioVision, Noldus Information Technology); configurações de detecção de limiar para identificar objetos mais escuros do que o fundo foram otimizadas para cada experiência. A pontuação das crises foi efectuada utilizando a seguinte escala de três fases estabelecida para as crises epilépticas induzidas pelo pentilenetrazol (Baraban et al., 2005): Fase 0, sem ou muito pouca actividade de natação; Fase I, aumento, breves períodos de actividade de natação; Fase II, comportamento de natação em circuito rápido “whirlpool-like”; e fase III, convulsões tipo clonus de corpo inteiro paroxismal, e uma breve perda de postura. Os peixes de tipo selvagem são normalmente marcados na fase 0 Ou I. As parcelas foram analisadas quanto à distância percorrida (em milímetros) e à velocidade média (em milímetros por segundo). Como relatado anteriormente (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), as variações de velocidade foram o doseamento mais sensível do comportamento das crises.

para estudos de electrofisiologia, as larvas de peixe-zebra foram brevemente paralisadas Com α-bungarotoxina (1 mg/ml) e imobilizadas em agarose a 1,2%; foram obtidas gravações locais de potencial de campo a partir de estruturas do forebrain utilizando uma técnica de eléctrodo único, como descrito anteriormente (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Foram obtidas sessões de gravação de potencial de campo local de 10 a 30 minutos, embebidas em Agarose, para cada peixe a 1 kHz. O sistema iZAP (Hong et al., 2016) foi utilizado para a monitorização não invasiva a longo prazo do peixe-zebra na ausência de um agente paralisante. O sistema retém autonomamente várias larvas de peixe-zebra por baixo de múltiplos eléctrodos integrados de superfície dentro das câmaras microfluídicas. as larvas scn1Lab foram continuamente monitorizadas durante 5 h. O potencial de campo eléctrico foi registado a 1 kHz continuamente, excepto pausas de 2 a 3 minutos para Alteração do meio de Tratamento Composto e lavagem. Os dados registados foram analisados utilizando MATLAB para gráficos em potencial de campo e análise de frequência.

o rastreio de bibliotecas compostas

compostos para o rastreio de drogas foram comprados a partir de produtos químicos Selleck e foram fornecidos como soluções DMSO de 10 mM. Selleck’s Ion Channel Ligand Library (Catalogue #L2700), GPCR Compound Library (Catalogue #L2200) and a customized 5-HT modulating library were used for screening. Os compostos de biblioteca estão listados no quadro Complementar 1. Em todas as telas da biblioteca de drogas, compostos foram codificados e experimentos foram realizados por investigadores que eram cegos para a natureza do composto. Foram obtidos registos basais do comportamento de locomoção a partir de mutantes em meio embrionário, como descrito anteriormente; foi então obtida uma segunda parcela de locomoção após uma alteração da solução para um composto de ensaio e um período de equilíbrio de 20 minutos. Compostos para estudos de locomoção foram dissolvidos em meio embrionário e foram testados a uma concentração de 250 µM, com uma concentração final de DMSO de 2,5%.

os critérios para uma designação positiva foram os seguintes: i) uma diminuição da velocidade média de ≥40%; e ii) uma redução para o nível 0 ou fase I do comportamento de convulsão na parcela de locomoção de, pelo menos, 50% dos peixes em estudo. Cada composto de ensaio classificado como “resposta positiva” no ensaio de locomoção foi avaliado quanto à toxicidade por visualização directa num estereomicroscópio após uma exposição de 90 minutos ao fármaco. A toxicidade (ou mortalidade) foi definida como ausência de batimento cardíaco ou movimento visível em resposta à estimulação externa em, pelo menos, 50% dos peixes em estudo. A hiperexcitabilidade foi definida como um composto que provoca um aumento ≥40% na velocidade de natação e/ou actividade de convulsão de fase III em pelo menos 50% dos peixes em estudo. Os resultados positivos identificados no ecrã de locomotiva primária foram confirmados utilizando o método de rastreio da locomoção num segundo ensaio com uma embraiagem independente de peixe-zebra. Os compostos foram então comprados separadamente de Sigma-Aldrich e testados usando o método de triagem de locomoção pela terceira vez em uma embraiagem independente de peixe-zebra. Os fármacos que reduziram a velocidade média de natação acima do limiar e não foram tóxicos nos três ensaios independentes de locomoção foram analisados de novo utilizando o teste electrofisiológico. Em estudos de electrofisiologia, os fármacos foram confirmados pela primeira vez numa concentração de 250 µM utilizando o ensaio de locomoção e, em seguida, o mesmo peixe-zebra foi avaliado utilizando uma gravação local do potencial de campo. Toda a triagem foi feita com compostos codificados e analisada pelos investigadores cegos para a identidade do composto.

Phylogenetic analysis

Phylogenetic analysis of human HTR2 and zebrafish Htr2 protein sequences were performed with the PhyML software under the SH-like probability-ratio test parameters (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Sequências de proteínas foram obtidas a partir do Ensembl humanos HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198), e peixe-zebra htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSDART00000024191) sequências.

análise quantitativa em tempo real da expressão do ARNm

os níveis de expressão dos genes de peixes-Zebra htr2 foram examinados utilizando ARN agrupado a partir de 25 cabeças ou caudas de 5 larvas homozigóticas do tipo dpf ou larvas mutantes do tipo scn1Lab e cérebros dissecados a partir de peixes adultos adultos de tipo selvagem. O RNA Total foi extraído utilizando reagente TRIzol® (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante e tratado com DNase I (Invitrogen). O mRNA purificado foi retrotranscrito para o cDNA usando o sistema de síntese de primeira cadeia SuperScript®III (Invitrogen)com uma mistura de oligo(dT) 20. Os níveis de expressão dos genes htr2 de zebrafish e do gene de limpeza eucariota, factor de Elongação 1 alfa 1, como 1 (eef1a1l1), foram determinados utilizando uma máquina StepOne™ em tempo Real PCR (sistemas biológicos aplicados). As reações foram realizadas em volumes de 20 µl em placas de 96 alvéolos usando SYBR®Green Master Mix (Applied Biosystems), com 250 nM primer e 3 µl de cDNA. As sequências de oligonucleótidos são enumeradas no quadro complementar 2. Os dados foram analisados a partir de três experiências independentes. Os dados foram expressos em valores Ct e utilizados para determinar os valores ΔCt.

estudos em seres humanos

após uma identificação bem sucedida dos compostos no nosso modelo de peixe-zebra e consideração da farmacocinética, as crianças foram prescritas Belviq® (lorcaserina) ao abrigo de um protocolo de uso compassivo no Children’s Hospital Colorado (IND 125307). Crianças qualificadas para o uso de Belviq® se tivessem uma mutação SCN1A ou um diagnóstico clínico da síndrome de Dravet, e falham em pelo menos dois medicamentos incluindo estiripentol em alguns casos e excluindo bloqueadores dos canais de sódio. As crianças foram obrigadas a realizar um electrocardiograma e ecocardiograma no início e de 6 em 6 meses durante a utilização do medicamento. Além disso, era-lhes exigido que realizassem visitas de acompanhamento de 3 em 3 meses para garantir um crescimento adequado, bem como que avaliassem os efeitos secundários adicionais. Foram necessários testes laboratoriais de 6 em 6 meses para incluir testes hematológicos, testes da função hepática e testes da função renal. A dose de Belviq® foi iniciada com 2, 5 mg ao deitar e aumentou gradualmente semanalmente, conforme necessário, até à dose máxima de 10 mg duas vezes por dia ou 0, 3 mg/kg/dia—conforme o que ocorreu primeiro.

a aprovação da Comissão de revisão institucional foi obtida para a recolha retrospectiva de dados, incluindo uma renúncia ao consentimento. Os dados foram extraídos de uma revisão retrospectiva dos registos médicos electrónicos no Children’s Hospital Colorado, incluindo idade, tipos de crises e frequência antes e após a utilização de Belviq®, acontecimentos adversos, dose de Belviq® e uso concomitante de medicação.

análise estatística

os dados são apresentados como o erro médio ± padrão da média (SEM), salvo indicação em contrário. Para a comparação entre dois grupos de estudantes T-teste foram usados. Quando a variância não tinha uma distribuição normal, o teste de Mann-Whitney U não-paramétrico foi usado. ANOVA de Sentido Único após o teste de comparação múltipla de Dunnett para análise contra uma amostra de controle ou comparações múltiplas de Holm-Sidak emparelhadas entre meios. As diferenças consideradas estatisticamente significativas estão indicadas com asteriscos (*P < 0, 05; * * P < 0, 01).

Resultados

Efeito de clemizole na apreensão de comportamento no peixe-zebra

Nós tratada scn1Lab mutante larvas (5 dpf) com clemizole em concentrações entre 30 e 400 µM e, em seguida, acompanhou a efeito no espontânea de apreensão comportamento automatizado de locomoção software de rastreamento. Com base em 250 ensaios repetidos de controlo da locomoção em mutantes scn1Lab não tratados, foi estabelecida uma redução da velocidade média de natação ≥40% (>1, 5 × DP) do valor basal como limiar para a supressão positiva do comportamento das crises. Clemizole (Fig. 1A) exibiu actividade antiepiléptica a 300 e 400 µM (exposição de 30 minutos) e a 100 µM (exposição de 90 minutos) (Fig. 1B); as exposições prolongadas eram tóxicas nas concentrações mais elevadas. Para determinar se o clemizol pode suprimir o comportamento espontâneo de convulsões num segundo mutante de peixe-zebra scn1, examinámos as larvas de mutante scn1Laa (5 dpf) no ensaio de detecção de locomoção. Larvas identificadas como comportamento convulsivo de fase III (por exemplo, convulsões corporais completas, actividade de natação de alta velocidade e uma breve perda de postura; Fig. 1C) foram confirmados como exibindo descargas eletrográficas com componentes interictais e ictais em gravações de campo subsequentes do cérebro dianteiro(Fig. 1D). A velocidade média de natação para larvas identificadas como S3 ou “mutantes putativos scn1Laa” foi significativamente mais elevada do que para os controlos aparentados, ou todas as larvas testadas (Fig. 1E); Mutantes foram confirmados como homozigotos scn1Laa por PCR post hoc. Em seguida, testamos medicamentos previamente mostrados para suprimir crises espontâneas na síndrome de Dravet e mutantes scn1Lab (250 µM estiripentol e 250 µM diazepam), bem como 250 µM lamotrigina (uma AED que pode agravar crises na síndrome de Dravet). Como esperado estiripentol e diazepam, mas não lamotrigina, suprimiu significativamente o comportamento de convulsão nas larvas mutantes de scn1Laa; o clemizol de 250 µM foi também eficaz neste ensaio(Fig. 1F). Em conjunto, estes estudos demonstram que o clemizol pode suprimir o comportamento convulsivo em duas linhas diferentes de peixe-zebra mutante scn1.

Investigação do mecanismo de ação para clemizole

o monitor secundário de drogas que utiliza mutantes scn1Lab

Terciário de triagem para identificar promissora de compostos de chumbo para o posto de saúde

5-HT receptor de expressão em larvas de peixe-zebra

Como clemizole tem grande afinidade de ligação para HTR2A e HTR2B, e ambos trazodone e lorcaserin são de 5-HT sinalização moduladores, procurou-se confirmar a expressão destes receptores em peixe-zebra. Proteína de alinhamento de sequências de humanos e de peixe-zebra HTR2 receptores revelou evolutiva de conservação do peixe-zebra orthologues, com Htr2aa e Htr2ab ambos exibindo 59.3% de proteína de identidade com o ser humano HTR2A; e um único HTR2B orthologue, Htr2b mostrando 62.0% de proteína de identidade. Quantificação do nível de expressão do htr2 utilizando cabeças ou caudas isoladas de 5 larvas mutantes do tipo dpf selvagem ou scn1Lab reveladas na cabeça expressões enriquecidas do htr2a e do htr2cl1. Resultados semelhantes foram obtidos a partir do cérebro de peixe-zebra adulto de tipo selvagem, uma vez que as larvas mutantes não sobrevivem até à idade adulta (Fig. suplementar. 4).

redução da frequência de Crises em doentes com síndrome de Dravet

Dravet é uma epilepsia infantil catastrófica e uma doença rara (http://www.rarediseases.org/) com resultados debilitantes incluindo epilepsia intractável, desenvolvimento cognitivo severamente limitado e risco de SUDEP. Os nossos dados pré-clínicos confirmam que a modulação da sinalização 5-HT pode suprimir convulsões associadas a mutações de perda de funções SCN1A. Como os moduladores 5-HT identificados são compostos aprovados pela FDA com perfis de segurança conhecidos, o tratamento com estes medicamentos reutilizados pode alterar a frequência de Crises em crianças com síndrome de Dravet. Esta abordagem translacional Visa doenças raras e devastadoras para as quais não são viáveis ensaios clínicos em larga escala (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

como o clemizol não é actualmente fabricado ou disponível na formulação de grau clínico e a trazodona pode actuar como agonista do receptor 5-HT, ou antagonista, dependendo da concentração (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), decidimos avaliar Belviq® (lorcaserin) sob um programa de uso compassivo off-label em uma pequena população de crianças com síndrome de Dravet. Estas crianças mostraram ser resistentes a pelo menos cinco AEDs aprovados. Cinco crianças (Idade Média: 11,8 anos; intervalo: 7-18 anos) heterozigóticas para uma eliminação no SCN1A foram tratadas prospectivamente com Belviq® e seguidas longitudinalmente no Children’s Hospital Colorado (Aurora, CO). O protocolo de tratamento foi aprovado pelo Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), e os pais de pacientes com síndrome de Dravet consentiram por escrito a participação de seus filhos. Revimos retrospectivamente o número comunicado de crises atónicas, mioclónicas e tónico-clónicas generalizadas (GTC), efeitos secundários e AED concomitantes.As características clínicas da síndrome de Dravet crianças tratadas com Belviq® estão resumidas na Tabela 1. Não houve mortes entre os cinco doentes tratados com Belviq®, e Belviq® foi bem tolerado sem que acontecimentos adversos graves tenham causado a cessação da terapêutica. Durante o tratamento off-label Belviq®, um doente esteve inicialmente isento de crises durante 3 semanas, um doente esteve isento de crises durante 2 semanas e um terceiro doente teve 1-2 dias sem crises por semana. Os cinco doentes apresentaram uma redução no número total de crises. As convulsões tónico-clónicas generalizadas foram significativamente reduzidas em doentes 1, 2 e 3. Na verdade, o paciente 2 experimentou uma redução de 90% em crises tónico-clónicas generalizadas, sem necessidade de medicação de resgate. Dois doentes continuam a tomar Belviq® sem aumento da frequência de crises e, como esperado, o efeito secundário mais comum observado foi uma diminuição do apetite. Um doente reiniciou a medicação uma segunda vez com melhoria interina durante um curto período de tempo e depois afunilou-se.

discusion

Clemizol, a first-generation antihistamine discovered in the 1950 s (Zierz et al., 1952), foi identificado como um potencial terapêutico para o tratamento da síndrome de Dravet usando peixe-zebra mutante scn1Lab para rastrear bibliotecas de drogas reutilizadas (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Aqui confirmámos uma actividade antiepiléptica para o clemizol usando um segundo modelo mutante de peixe zebra scn1. Infelizmente, o clemizol é rapidamente metabolizado em ratinhos com uma semi-vida plasmática <10 min (em comparação com 3, 4 h em humanos) (Nishimura et al., 2013), limitando sua avaliação em modelos murine. Usado com sucesso como um anti-histamínico (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) com estudos agudos e crónicos que relatam uma baixa ordem de toxicidade (Finkelstein et al., 1960), clemizole não é mais fabricado e não está atualmente disponível para administração clínica off-label. Na falta de meios para avaliar eficazmente o clemizol em modelos pré-clínicos de roedores, utilizámos peixe-zebra para o engajamento alvo (receptores 5-HT) e identificação de fármacos relacionados (trazodona e lorcaserina) com perfis de segurança adequados que facilitam a tradução rápida para uma aplicação clínica. Também é descrito o uso compassivo, a prescrição off-label de Belviq® (lorcaserina) a doentes com síndrome de Dravet clinicamente intratável.

os antagonistas dos receptores H1 anti-histamínicos estão normalmente contra-indicados em populações de doentes pediátricos (Miyata et al., 2011) e o rastreio destas drogas confirmou a sua incapacidade de suprimir (e, em alguns casos, exacerbar) as apreensões de peixe-zebra do scn1. Dados de ligação revelaram uma afinidade anteriormente desconhecida de clemizol para os receptores HTR2A e/ou HTR2B. Uma tela fenotípica subsequente de bibliotecas-alvo identificou dois compostos moduladores de 5-HT, trazodona e lorcaserina, capazes de suprimir apreensões comportamentais e eletrofisiológicas de uma forma comparável ao clemizol. Belviq® (lorcaserina) é um agonista HTR2C aprovado pela FDA, prescrito para o controle de peso crônico (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodona) é também um antidepressivo aprovado pela FDA, geralmente prescrito para distúrbios do sono (Mendelson, 2005). É frequentemente classificado como um antagonista inverso HTR2A e HTR2C e inibidor de captação 5-HT (Stahl, 2009). Contudo, estudos em ratos sugerem que a trazodona, ou o seu metabolito meta-clorofenilpiperazina (mCPP), pode actuar como agonista do HTR2C em concentrações mais elevadas (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Notavelmente, o tratamento crónico com trazodona demonstrou anteriormente ser protector contra crises electroconvulsivas induzidas em ratinhos (Javan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), apoiando os nossos dados do peixe-zebra mutante scn1Lab. Uma acção mediada pelo receptor 5-HT para o clemizol é também consistente com um ecrã fenotípico recente, onde os moduladores da sinalização serotoninérgica (incluindo o clemizol) demonstraram ser um tratamento eficaz num modelo pré-clínico da doença de Machado-José (Teixeira-Castro et al., 2015); e estudos aqui sugerem que clemizole e trazodona merecem maior desenvolvimento para testes off-label em pacientes com síndrome de Dravet.

nossos resultados também adicionam a um crescente corpo de evidências sugerindo modulação da sinalização serotoninérgica como um potente supressor da atividade de convulsão, especialmente em crises catastróficas na infância como síndrome de Dravet. Recentemente, 7 dos 10 doentes em tratamento de dose baixa com o bloqueador recaptação de 5 HT fenfluramina foram auto-notificados como estando isentos de convulsões durante 1 ano (Ceulemans et al., 2016). Foi notificado um ligeiro espessamento de uma ou duas válvulas cardíacas em dois destes doentes, consistente com uma possível relação entre o uso de fenfluramina e hipertensão pulmonar (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Em humanos, HTR2A e HTR2C são expressos no SNC, enquanto a expressão HTR2B é enriquecida no coração (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Mais especificamente, o HTR2C é expresso numa subpopulação de interneurões inibitórios (Liu et al., 2007) e a activação destes receptores com 5-HT aumenta a inibição sináptica mediada pelo GABA (Boothman et al., 2006) ou seja, o mecanismo de Acção antiepiléptico subjacente a muitos medicamentos antiepilépticos habitualmente prescritos. De facto, a maioria dos estudos pré-clínicos sugerem que a activação dos receptores HTR2A e/ou HTR2C tem efeitos antiepilépticos (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), que é um mecanismo razoável de ação ligando clemizole, lorcaserin, trazodone, e o bloqueador de recaptação 5-HT fenfluramina (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Curiosamente, a expressão de htr2b no cérebro de peixe-zebra foi relativamente baixa, sugerindo ainda que estas drogas potencialmente exercem atividade antiepiléptica através da ativação do receptor HTR2A ou HTR2C. Curiosamente, estudos em moscas da Drosophila que transportam a mutação humana K1270T SCN1A no gene do canal para-sódico mostraram que a suplementação com um precursor 5-HT (5-hidroxitriptofano) resgata o fenótipo de crises induzidas pelo calor (Schutte et al., 2014). Adicionalmente, um estudo recente utilizando mutantes scn1Lab avaliou 13 compostos de sinalização 5-HT e também sugeriu um potencial papel antiepiléptico para moduladores de sinalização 5-HT (Sourbron et al., 2016). No entanto, estes últimos estudos com peixes-Zebra utilizaram um protocolo fundamentalmente diferente (24 h versus 30-90 min de exposição ao fármaco) não validado previamente como identificando com sucesso os AEDs utilizados na síndrome de Dravet (benzodiazepinas, valproato, estiripentol, brometos e dieta cetogénica). Além disso, concentrações de medicamentos 10 vezes mais baixas do que as que demonstramos serem eficazes no peixe-zebra (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), e relatando uma ação antiepiléptica para o alucinogênio TCB-2 (Fig. 5), sugere que a comparação directa dos dados dos laboratórios que utilizam procedimentos diferentes deve ser interpretada com precaução.

de um modo geral, concluímos que os peixes-Zebra mutantes são um modelo adequado para o rápido rastreio e descoberta de IPA novas que, com perfis de segurança adequados, podem informar directamente os cuidados clínicos para as populações de doentes em risco, tais como a síndrome de Dravet.

Abreviaturas

Abreviaturas
• 5-HT

  serotonina

• AED

  drogas antiepilépticas

• dpf

  dias pós-fertilização

• GPCR

  G-protein-coupled receptor

• iZAP

  integrado a plataforma de análise de peixe-zebra

Agradecimentos

gostaríamos de agradecer os membros do Baraban laboratório, Brian Grone e Mateus Dinday em particular, útil para debates no decurso destes estudos.

financiamento

S. C. B reconhece o financiamento da NINDS R01 grant no. NS079214, UCSF Catalyst Award and the Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

material suplementar

material suplementar está disponível no Cérebro online.