Cisplatina ototoxicidade envolve citocinas e STAT6 de sinalização de rede

Reagentes

Cisplatina e 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-il)-2, 5-difenil-tetrazolium bromide (MTT) foram adquiridos da Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, EUA). Os materiais de cultura plástica foram comprados a Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, EUA). O meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM), o soro fetal bovino (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) e outros reagentes de cultura tissue foram obtidos da Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). As proteínas recombinantes IL-4 e IL-13 do rato, os anticorpos contra IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 e os kits de teste de imunoabsorção enzimática (ELISA) (QuantikineR) para citocinas foram adquiridos a partir da R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Estes anticorpos foram utilizados para imunohistoquímica a uma concentração de 1:200. Anticorpos para P-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65), e IkB foram comprados a Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, EUA).

cultura celular e viabilidade

o estabelecimento e caracterização das células auditivas IE-OC1 condicionalmente imortalizadas foi descrito no nosso relatório anterior 1. A expressão de marcadores específicos de OHC como Math1 e Myosina 7a sugere que células HEI-OC1 representam precursores de OHC. As células HEI-OC1 foram mantidas em DMEM de elevada glucose (Gibco BRL) contendo 10% de FBS. Para os experimentos descritos abaixo, as células HEI-OC1 foram cultivadas sob as seguintes condições permissivas: 33 ° C e 5% de CO2 em DMEM complementadas com 10% de FBS. Células (3 × 104 células/poço de 24 placas de poços) foram incubadas com 20 µM de cisplatina por 24 h. Para determinar a viabilidade celular, MTT (0,25 mg) foi adicionado 1 ml de suspensão celular de 4 h. Depois de lavar as células, e três lavagens com PBS (pH 7.4), o formazan insolúvel produto foi dissolvido em DMSO. A densidade óptica (OD) de cada poço de cultura foi então medida usando um leitor de Microplacas (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) a 590 nm. A do das células de controlo foi tomada para indicar 100% de viabilidade. Para examinar os efeitos de várias citocinas, anticorpos neutralizantes contra citocinas foram adicionados às culturas por 30 min, após o que foram cultivadas com 20 µM de cisplatina por 24 h.

Animais

STAT4−/− (cruzamento da geração N10), STAT6−/− (cruzamento de geração N6), e WT BALB/c os ratos foram adquiridos a partir do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA). Os ratinhos homozigóticos STAT4 e STAT6 KO foram identificados pela PCR. Os ratos KO não mostraram nenhuma anormalidade no desenvolvimento. Foram realizadas experiências em ratinhos com 6 semanas de idade, e todos os ratinhos tinham a mesma idade em 3 dias. Os ratos foram alimentados com uma dieta comercial padrão, enquanto alojados a uma temperatura ambiente de 20-22 ° C e com uma humidade relativa de 50 ± 5% sob um ciclo escuro de 12:12 h numa instalação específica isenta de agentes patogénicos. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso em animais na Wonkwang University School of Medicine.

Luciferase reporter assay

as células foram transfectivamente transfectadas com plasmídeo repórter da NF-kB utilizando o reagente de transfecção, Lipofectamina 2000. Após 36 H de incubação, as células foram tratadas com cisplatina durante 12 h na presença de anticorpos neutralizantes da citoquina. As células foram então lavadas duas vezes com tampão PBS e posteriormente lisadas em tampão lysis (Promega, Madison, WI, EUA). Uma alíquota de 20 µl do lisato foi então misturada com 100 µl de reagente de ensaio da luciferase, após o que a intensidade luminosa emitida foi medida utilizando um luminómetro AutoLumat LB953 (EG e G Berthold, Bad Wildbad, Alemanha). Finalmente, a actividade da luciferase foi medida em triplicado, em média, e depois normalizada em relação à actividade da β-galactosidase utilizando o sistema de doseamento da galactosidase (galactosidase, Tropix Inc., MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

transfecção com siRNA constructs

siRNAs Predesinhadas contra mouse STAT4, STAT6, and control scrambled siRNA were purchased from Santa Cruz Biotechnology. As cadeias de sentido de siRNAs contra STAT4 e STAT6 são as seguintes. O STAT4 siRNAs construção é um conjunto de três sequências de siRNA da seguinte forma: Duplex 1 Sentido Vertente: 5′-IndexTermGUA CGU GUG GUA AUU UCA-3′, Duplex 2 Sentido Vertente: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA-3′, e Duplex 3 Sentido Vertente: 5′-IndexTermCUG UGC UGA UGA UUU CUA-3′ (mRNA de adesão número: NM_011487). O STAT6 siRNAs construção é um conjunto de três sequências de siRNA da seguinte forma: Duplex 1 Sentido Vertente: 5′-IndexTermGAU CGU UUC UGU UAC AAC-3′, Duplex 2 Sentido Vertente: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AGO-3′, e Duplex 3 Sentido Vertente: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG-3′ (mRNA de adesão número: NM_009284). As células foram transferidas transitoriamente com 100 nM de construções siRNA em reagente de transfecção de X-tremeGENE siRNA (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Após incubação a 33 ° C e 5% de CO2 durante 36 h, as células foram ainda tratadas com cisplatina durante 24 h. As amostras foram então preparadas e analisadas para análise de Viabilidade ou análise de Western blot. A interferência da expressão foi confirmada pela análise imunoblot.Para medir a secreção de citoquinas pró-inflamatórias a partir das células tratadas com cisplatina, colheram-se sobrenadantes de cultura em cada momento e os níveis de citoquinas pró-inflamatórias secretadas foram então determinados por ELISA (Kits de citoquinas Quanticinas citocinas).; R & D Systems Inc.) de acordo com as instruções do fabricante.

Preparação de cytosolic e nuclear extrai

Células foram lavadas com o frio e PBS, raspado e centrifugado a 1 000× g por 5 min a 4 °C. O pellet de células foi, em seguida, em suspensão em 200 µl de tampão de lise (10 mM HEPES, pH 7.9, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl, 0,5 mM phenylmethylsulfonyl de flúor, e 0,5 mM dithiothreitol) e, em seguida, incubadas em gelo por 15 min. No final da Incubação, foram adicionados 10 µl de 10% NP-40 e o tubo foi ventilado durante 10 s. Após centrifugação a 13 000× g durante 1 min a 4 ° C, o sobrenadante (extracto citosólico) foi recolhido e armazenado a -80 °C, enquanto o sedimento foi transformado para obter os extractos nucleares. O sedimento foi então ressuspenso em tampão de extracção (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM e glicerol 25% (vol/vol)) e incubado durante 30 minutos a 4 °C. os extractos nucleares foram isolados por centrifugação a 13 000× g durante 30 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi então removido e armazenado a -80 °C até ser utilizado para análise das manchas ocidentais. Finalmente, a concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry.

Western blot analysis

Western blot analysis was performed as follows. Brevemente, as células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS gelado. Os lisatos fraccionados totais e citosólicos foram então submetidos a electroforese em 12% de géis SDS-poliacrilamida por 3 h a 20 mA, após o que foram transferidos para nitrocelulose. A membrana foi então incubado em 5% (peso/vol.) seca proteína do leite em PBS contendo 0,05% de (vol/vol) de Tween-20 (PBS-T) por 1 h, após o qual elas foram lavadas em PBS-T, e, ainda mais, reagiu com anticorpo primário (1:1 000) por 1 h. De seguida, a membrana foi extensivamente lavadas com PBS-T e, em seguida, incubadas com anticorpo IgG anti-coelho conjugado com HRP (1:3 000) por 1 h. Depois de várias lavagens, bandas de proteína na membrana foram visualizados usando quimioluminescente reagentes de acordo com as instruções do fabricante (Supersignal Substrato; Pierce, Rockford, IL, EUA).

in vivo experiment of cisplatin ototoxicity

todos os ratinhos foram aleatoriamente divididos em dois grupos de seis ratinhos cada. Os animais do grupo 1, considerados como um grupo de controlo, receberam injecção intraperitoneal de PBS. O grupo 2 recebeu cisplatina (4 mg / kg de peso corporal) por injecção intraperitoneal durante 4 dias consecutivos. Os animais foram então abatidos sob anestesia utilizando gás CO2 no dia seguinte à última injecção de cisplatina, após a qual foi removido o osso temporal da orelha direita.

medição de ABR

para análise posterior do limiar auditivo, o ABR foi medido antes e 24 h após o tratamento final da Cisplatina. Foram então comparadas as alterações do limiar ABR entre o pré-tratamento e o pós-tratamento. Os ratos foram anestesiados utilizando um cocktail de cetamina (40 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e mantidos quentes com um tampão de aquecimento durante a gravação da ABR. Um eletrodo de agulha subdermal (ativo) foi inserido no vértice, enquanto eletrodos de referência e terra foram inseridos subdermalmente na pele solta por baixo das pinnas de orelhas opostas. Os estímulos de ensaio consistiram em explosões de fase alternada em frequências de 4, 8, 16 e 32 kHz. Sinais foram gerados usando Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen software. Cada rajada de Tom (duração de 1 ms) foi colocada através de uma janela Blackmann, e teve um tempo de subida-queda de 0,5 ms sem Planalto. Os estímulos foram calibrados antes de cada sessão de teste, registrando a saída do altifalante com um microfone colocado ao nível da cabeça dos animais. As formas de onda ABR foram calculadas em média em resposta a 300 rajadas de tom em cada frequência testada. A cada frequência, a amplitude do sinal era automaticamente atenuada em 10 dB, passando de 90 dB SPL até que as ondas ABR desaparecessem em traços registados com filtros de 100-3 000 Hz. O julgamento do limiar foi feito off-line por dois observadores independentes, experimentalmente cegos com base nos registros ABR.

preparação Superficial do órgão dos explantes de Corti

todos os ratinhos foram mortos no dia seguinte à injecção final de cisplatina. O osso temporal foi dissecado e fixado em 4% de paraformaldeído durante 16 h a 4 ° C, e lavado com 0,1 M PBS. O osso temporal foi descalcificado com 10% de EDTA em PBS durante 3 dias. A cóclea foi cuidadosamente dissecada. Em seguida, os estrias vascularis e ligamentos Espirais foram dissecados, deixando o órgão de Corti. A meia volta da cóclea foi imersa em phalloidin marcado com TRITC (Sigma P1951, 1: 100) em PBS por 20 minutos. Após três lavagens com PBS, a amostra foi examinada ao microscópio de fluorescência utilizando filtros adequados para TRITC (excitação: 510-550 nm, emissão: 590 nm).

coloração imunohistoquímica e ensaio de TUNEL

o osso temporal removido foi fixado em 4% de paraformaldeído durante 16 h E depois descalcificado com 10% EDTA em PBS durante 2 semanas, após o que foi desidratado e incorporado na cera de parafina. Secções de 5 µm foram desparafinizadas em xileno e rehidratadas através de concentrações classificadas de etanol. Para o estudo da imunohistoquímica, foi utilizado um kit de imunohistoquímica (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, EUA) e os procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. A peroxidase endógena foi então bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio durante 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Após os cortes foram lavados em PBS, ligação não específica foi bloqueado com 1% de albumina de soro de bovino de 1 h. Primária de anticorpos (1:200 diluído), em seguida, foram adicionados aos slides, após o qual a incubação procedeu por 1 h. Depois de repetidas lavagens com PBS, os cortes foram incubados com anticorpo secundário biotinilado por 30 min e, em seguida, cobertos por 30 min com um anticorpo secundário que contêm peroxidase de rábano. Por último, as secções foram manchadas numa solução de substrato recentemente preparada (3 mg de 3-amino-9-etilcarbazol em 10 ml de tampão de acetato de sódio (pH 4.9), 500 µl de dimetilformamida, 0,03% de peróxido de hidrogénio) durante 5 minutos. Os núcleos das células imuno-manchadas foram então contrastados com a hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich Co.). Foram detectadas células apoptóticas in situ utilizando o ensaio de TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Alemanha). Brevemente, uma secção foi desparafinizada e reidratada. Após a incubação com 20 µg/ml de proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), a peroxidase endógena foi bloqueada por incubação, as amostras em 2% de H2O2 em metanol por 30 min a RT. Ao lado, o tecido secções foram lavadas em PBS e incubadas com solução de etiquetagem por 1 h a 37 °C. Os núcleos que foram, em seguida, counterstained com iodeto de propidium (0,5 µg/ml, Molecular Probes) por 10 min a RT. Após lavagens com PBS, a amostra foi analisada em um microscópio de fluorescência.

transcriptase reversa-PCR amplificação

para a PCR coclear, o osso temporal do ouvido esquerdo foi rapidamente colhido e imerso em RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) till use at -20 °C. Then, whole cochleae was dissected out and used to extract total RNA by the use of TRIzol (Invitrogen) according to the manufacturer’s protocols. Após a extração do RNA total usando Trizol (Invitrogênio), cDNA de cadeia simples foi sintetizado a partir do RNA total. Próximo de PCR com Taq DNA polimerase (Takara, Takara Shuzo, Japão) foi realizada submetendo as amostras a 30 ciclos de 95 °C por 40 s, 58 °C por 40 s e 72 °C por 50 s. Dez microlitros dos produtos de PCR foi, então, separados em 1,2% gel de agarose e visualizados sob luz UV. As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação PCR foram as seguintes:: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reverse, 5 ‘- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

análise estatística

cada experiência foi realizada pelo menos três vezes, e todos os valores comunicados representam a média ± DP das análises triplicadas. A análise multivariada estatística foi realizada por análise de variância e testes Duncan, usando o software estatístico SPSS 11 (Chicago, IL, USA). A ANOVA bidirecional e / ou a ANOVA de Sentido Único foram utilizadas para determinar o significado dos resultados. Os resultados estatísticos foram revistos por um bioestatístico de nível mestre. Valores de P < 0.5 foram considerados estatisticamente significativos.