Chimerism de teste é usado para a rotina de documentação de engraftment e pós-transplante de acompanhamento de transplante alogênico de destinatários. As células dadoras e receptoras podem ser distinguidas por testes de marcadores genéticos que são determinados antes do transplante.2 em transplantes de sexo desigual quando o receptor e doador são de sexo diferente, a proporção de células femininas e masculinas é geralmente determinada pela análise de marcadores cromossômicos sexuais, na maioria das vezes com peixes.8,9 a avaliação do número variável de repetições tandem (VNTR) ou repetições tandem curtas (STR) pela PCR tornou-se o método mais valioso para a determinação do quimerismo em transplantes com correspondência sexual.Foram desenvolvidos 10 métodos diferentes para a detecção de MRD. A análise morfológica da medula pode identificar a doença residual ocupando mais de 5% do espaço da medula e, portanto, falta a sensibilidade necessária para a detecção precoce. Além disso, é muitas vezes difícil diferenciar uma pequena população blástica de leucemia de explosões hematopoiéticas derivadas de doadores normais repopulando a medula sem usar marcadores adicionais. Testes específicos podem detectar MRD quando há um marcador tumoral específico, como uma anormalidade citogenética específica, um imunofenótipo específico que pode ser identificado por FACS, sequências específicas de DNA ou RNA que podem ser amplificadas por PCR ou um padrão de crescimento específico em testes clonogênicos. Na ausência de um marcador de tumor específico para MRD, testes de quimerismo pode ser usado para detectar células derivadas do receptor. A detecção de células derivadas do receptor pode nem sempre estar correlacionada com o risco de recidiva. Células receptores que contribuem para o quimerismo misto (MC) pertencem ao clone maligno ou podem ser células hematopoiéticas normais, ou mesmo células estromais. Durante as primeiras semanas após a utilização de células do receptor do transplante alogénico padrão ainda podem ser detectadas quando são utilizados testes sensíveis.9, 11 estes são principalmente células T sobrevivendo ao regime de condicionamento. As células hospedeiras podem ser detectadas a níveis baixos (<1%) mesmo mais tarde no curso pós-transplante. O MC é detectado mais frequentemente após condicionamento não-mieloablativo.2 assim, as sondas de marcadores específicos do tumor são provavelmente superiores e mais precisas do que as sondas de desfasamento sexual para detecção de MRD.12 No entanto, mesmo a detecção de MRD com testes específicos do tumor pode nem sempre estar correlacionada com o risco de recaída. Foram notificados testes PCR positivos para a BCR / ABL em indivíduos saudáveis.A translocação t(14;18) foi detectada em linhagens diferentes dos linfócitos B em doentes com linfoma não-Hodgkin.Pode haver um limite para a DRM ser clinicamente significativo. Em várias doenças, como a LMA com t (8;21), 15 remissões de longa duração foram observadas na presença de MRD detectada pela PCR, enquanto em outras, tais como em leucemia promielocítica aguda, prognóstico de positividade PCR recidiva.Mais uma vez, isto pode estar relacionado com a sensibilidade do teste de PCR específico e com o limiar de significância clínica. Células malignas residuais podem estar em um estado dormente17 sem o potencial de contribuir para a recaída, por causa da falta ou ganho de uma segunda alteração genética. Em algumas doenças pode ocorrer diferenciação parcial para células mais maduras e estas células podem não ter o potencial de proliferar. A DRM pode estar sob vigilância imunitária, ou as células MRD estão numa fase apoptótica, tornando-as irrelevantes para a recorrência da doença. Os testes de PCR sensíveis não preservam a morfologia celular e, portanto, não é claro quais as células correlacionadas com MRD nestas diferentes configurações.
The Duet™ system for combined simultaneous morphological and cytogenetic multiparametric analysis offers a few advantages that may help in disclosing the relevance of MRD detection. Este sistema procura automaticamente um grande número de células (aproximadamente 150000 células por lâmina) por pequenos subconjuntos celulares com fenótipo citogenético ou imunológico único. A sensibilidade para a detecção de pequenas populações é aumentada. Numa série de experiências de diluição, demonstrámos que a sensibilidade para a detecção de uma célula masculina numa população de células femininas é superior a 1:50000, no entanto, devido à especificidade limitada deste título, a melhor detecção ocorre entre 1:10000 e 1:50000 (ver apêndice). Tal como observado na análise de amostras de medula óssea do doente 1 (última análise) e do doente 2, o sistema Duet™ pôde detectar populações muito pequenas de células receptores XY não detectadas por peixes de rotina. A exatidão quantitativa do peixe depende da frequência observada e do número de células pontuadas, o que melhora com a contagem de mais células.18 a pontuação de um número tão grande de células não é prática com peixes manuais, mas o sistema automático Duet™ é capaz de digitalizar 10000 células/min em microscopia de campo brilhante e 2000-10000 células/h em microscopia fluorescente, apoiando assim a necessidade de digitalização rápida e eficiente e aumento da sensibilidade.Os testes sensíveis são frequentemente associados a uma especificidade reduzida e a uma taxa relativamente elevada de falsos positivos. Com peixes padrão, pode ocorrer uma pontuação falso-positiva devido à hibridação não específica da sonda. Pode ocorrer uma pontuação falsa positiva para translocações cromossómicas devido a associação espacial aleatória e fusão óptica.18 o sistema Duet™ pode potencialmente melhorar a especificidade, identificando a morfologia das células na população pesquisada. A detecção da positividade dos peixes, numa pequena população, mas com uma aparência morfológica Duet™ uniforme, torna mais provável que seja um verdadeiro positivo do que quando as células positivas estão espalhadas por diferentes linhagens não relacionadas. A especificidade da detecção de MRD com testes de quimerismo não específicos pode também ser melhorada. Como discutido acima, as células do receptor podem pertencer ao clone maligno (como no paciente 1), podem ser células hematopoiéticas normais (paciente 3, paciente 1 após tratamento com STI571) ou células não hematopoiéticas/estromais (como osteoblastos, paciente 2). O sistema Duet™ permite a diferenciação entre estas opções pela aparência morfológica. Temos mostrado na análise do paciente 1, e dois pacientes (dados não mostrados), que a identificação do destinatário características (tais como o sexo oposto, citogenética) dentro de blastos ou células imaturas prevê evidente recaída e precede-lo por algumas semanas a alguns meses. No paciente 1, análises separadas de peixes revelaram uma pequena população receptora de XY (0,6%), e uma pequena população positiva BCR/ABL (0,8%) que poderia ser considerada dentro da taxa falsa positiva da análise de peixes. No entanto, o sistema Duet™ mostrou que uma grande proporção das células receptores XY eram blastos (e também BCR/ABL positivo por um segundo teste FISH nas mesmas células) e poderia, assim, prever que o paciente está destinado a recidiva. A identificação de uma pequena população receptora dentro de células hematopoiéticas Maduras pode não prever recaídas. Em três pacientes adicionais (dados não mostrados) temos documentado remissão contínua na presença de uma pequena população receptora com morfologia madura. São necessários estudos de maior escala com um seguimento mais longo para confirmar a associação entre a morfologia das células residuais do hospedeiro e o risco de recaída em doentes sem outros marcadores únicos para o clone maligno.
o sistema é relativamente simples de operar, é principalmente Automático, seu tempo de execução e custos são comparáveis a outros sistemas de detecção de quimerismo e MRD, como o peixe padrão e PCR e pode ser adequado para testes em larga escala. Para além do equipamento e dos kits do sistema, é necessário apenas equipamento normalizado facilmente disponível em grandes laboratórios (Ver apêndice).Nos últimos anos, o estudo do quimerismo em diferentes subconjuntos celulares ganhou interesse e popularidade.19,20 isto é de extrema importância após transplantes não-mieloablativos.Foi demonstrado por alguns grupos que o quimerismo completo dentro dos linfócitos T é necessário para a indução de GVL, pelo que a MC neste subgrupo celular pode estar associada a um risco aumentado de recidiva, especialmente de neoplasias agressivas e de crescimento rápido.2,19 testes de quimerismo de subconjuntos celulares precisam de uma triagem pesada e demorada de células com o potencial teórico de perder algumas células durante esse processo. Como discutido no Apêndice A preparação de lâminas para a análise Duet™ não causa perda ou redução de qualquer população celular. O sistema Duet™ utiliza o slide manchado da MGG para localizar linfócitos e outros subconjuntos celulares e também pode usar manchas imunocitoquímicas (como anticorpos monoclonais anti-CD3) para localizar estas células. Numa segunda fase, os peixes podem ser aplicados para testes de quimerismo em transplantes não compatíveis com o sexo. A apresentação do caso do doente 3 mostra como o sistema foi utilizado para seguir o quimerismo num doente após transplante não-mieloablativo e como a conversão para quimerismo completo após a retirada da ciclosporina previu a ocorrência de respostas GVHD e GVT.
este relatório centra-se no uso de Duet™ após transplante de medula óssea, no entanto, pode haver muitas outras implicações. O sistema também pode ajudar a estudar as células e linhagens que abrigam um marcador citogenético ou imunofenotípico único, como a fusão BCR/ABL (como visto no paciente 1) e correlacionar sua morfologia com o risco de recaída após quimioterapia padrão. Pode ajudar a revelar a natureza do MRD em diferentes doenças malignas e por que a detecção de MRD nem sempre é preditiva de recidiva. Em certos casos, podem procurar-se pequenas populações de células dadoras ou micro-quimerismo. Por exemplo, o microchimerismo linfático–hematopoiético Sistémico detectado após transplante de órgãos sólidos pode prever tolerância ao órgão transplantado e dirigir a terapêutica imunossupressora.21 a pequena população materna que contamina os alografts sanguíneos do cordão umbilical também pode ser detectada de forma semelhante e pode ter implicações no risco pós-transplante de GVHD.
em conclusão, adicionando a análise morfológica de pequenas populações de células com malignidade ou marcadores associados ao receptor, o sistema Duet™ pode melhorar a precisão dos testes de quimerismo e MRD, e delinear o seu significado clínico. Este sistema merece um estudo mais aprofundado em ensaios de maior escala.