ADN tumoral circulante

considerações pré-analíticas edit

quando o sangue é recolhido em tubos EDTA e armazenado, os glóbulos brancos começam a lirar e a libertar ADN do tipo selvagem genómico para a amostra em quantidades tipicamente muitas vezes superiores às do ctDNA. Isto torna mais difícil a detecção de mutações ou outros biomarcadores ctDNA. A utilização de tubos de estabilização celular comercialmente disponíveis pode prevenir ou retardar a lise de glóbulos brancos, reduzindo assim o efeito de diluição do ctDNA. Sherwood et al demonstraram detecção superior de mutações KRAS em amostras combinadas recolhidas em tubos EDTA K3 e Streck BCT. As vantagens dos tubos de estabilização celular podem ser obtidas em situações em que o sangue não pode ser processado imediatamente para o plasma.Outros procedimentos podem também reduzir a quantidade de ADN do tipo selvagem “contaminante” e tornar a detecção de ctDNA mais viável .:

• Nunca congelar uma amostra de sangue antes da extração do plasma para ctDNA análise
• Processo a amostra de plasma dentro de 2 a 4 horas (se colhido em EDTA tubo)
• Nunca use heparinizado tubos de heparina inibe a PCR imitando a estrutura helicoidal do DNA
• Execute um duplo passo de centrifugação (centrífuga, o sangue para remover o plasma, em seguida, repita no plasma para remover detritos no fundo do tubo) para remover mais detritos celulares antes de extração de DNA.
• Plasma é melhor do que o soro para ctDNA de recuperação

Extração de ctDNAEdit

O principal recurso de ctDNA análise é de que ele é extraído de uma maneira non-invasive através de coleta de sangue. A aquisição de cfDNA ou ctDNA requer normalmente a recolha de aproximadamente 3 ml de sangue em tubos revestidos de EDTA. O uso de EDTA é importante para reduzir a coagulação do sangue. As fracções de plasma e soro do sangue podem ser separadas através de um passo de centrifugação. ctDNA ou cfDNA podem ser posteriormente extraídos destas fracções. Embora o soro tende a ter maiores níveis de cfDNA, isso é principalmente atribuído ao DNA de linfócitos. Níveis elevados de contaminação de cfDNA são sub-ótimos porque isso pode diminuir a sensibilidade da detecção de ctDNA. Assim, a maioria dos estudos utiliza plasma para isolamento ctDNA. O Plasma é então processado novamente por centrifugação para remover as células sanguíneas intactas residuais. O sobrenadante é utilizado para a extracção do ADN, que pode ser realizada utilizando kits comercialmente disponíveis.

Analysis of ctDNAEdit

The analysis of ctDNA after extraction requires the use of various amplification and sequencing methods. Estes métodos podem ser separados em dois grupos principais com base em se o objetivo é interrogar todos os genes em uma abordagem não alvo, ou se o objetivo é monitorar genes específicos e mutações em uma abordagem alvo.

aproachesedit

pode ser necessário um genoma completo ou abordagens sequenciais completas para descobrir novas mutações no ADN tumoral, enquanto monitoriza a carga da doença ou rastreia a resistência aos medicamentos. Abordagens não orientadas também são úteis na pesquisa para observar a heterogeneidade do tumor ou para descobrir novas metas de drogas. No entanto, embora possam ser necessários métodos não visados em determinadas aplicações, são mais dispendiosos e têm menor resolução. Isto torna difícil a detecção de mutações raras, ou em situações em que estejam presentes baixos níveis de ctDNA (tais como uma doença residual mínima). Além disso, pode haver problemas que distinguem o ADN das células tumorais do ADN das células normais, utilizando uma abordagem genómica global.

genoma inteiro ou sequenciação exome normalmente usam tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento. Limitar a sequenciação a apenas todo o exome em vez disso pode diminuir a despesa e aumentar a velocidade, mas ao custo de perder a informação sobre mutações nas regiões reguladoras não codificantes do DNA. Enquanto simplesmente olhar para polimorfismos de DNA através da sequenciação não diferencia DNA de tumor ou células normais, este problema pode ser resolvido comparando com uma amostra de controle de DNA normal (por exemplo, DNA obtido através de um esfregaço bucal.) Importante, todo o genoma e sequenciamento de exome são úteis para a descoberta inicial da mutação. Isto fornece informações para a utilização de técnicas específicas mais sensíveis, que podem então ser utilizadas para fins de monitorização de doenças.A sequenciação do genoma completo permite recuperar as propriedades estruturais do cfDNA, o tamanho dos fragmentos e seus padrões de fragmentação. Estes padrões únicos podem ser uma importante fonte de informação para melhorar a detecção de ctDNA ou localizar o tecido de origem destes fragmentos. A selecção de tamanhos de fragmentos curtos (< 150bp) com métodos in vitro ou in silico pode melhorar a recuperação de mutações e aberrações de número de cópias.Este método foi originalmente desenvolvido pelo laboratório de Bert Vogelstein, Luis Diaz, e Victor Velculescu na Universidade Johns Hopkins. Ao contrário da cariotipagem normal, onde um corante é usado para manchar bandas cromossômicas, a fim de visualizar os cromossomos, a cariotipagem digital usa sequências de DNA de loci em todo o genoma, a fim de calcular a variação do número de cópias. As variações do número de cópias são comuns em cancros e descrevem situações em que a perda de heterozigosidade de um gene pode levar à diminuição da função devido à menor expressão, ou duplicação de um gene, o que leva à sobreexpressão.

Personalizado de análise de reorganizadas extremidades (PARE)Editar

Depois de todo o genoma seqüenciado usando uma alta taxa de transferência de sequenciamento de método, tal como o Illumina HiSeq, PARE é aplicado aos dados para analisar os rearranjos cromossómicos e translocações. Esta técnica foi originalmente projetada para analisar DNA tumoral sólido, mas foi modificada para aplicações ctDNA.

metilação do ADN e Hidroximetilationedit

a marcação epigenética adequada é essencial para a expressão normal do gene e para a função celular e as alterações aberrantes nos padrões epigenéticos são uma marca distintiva do cancro. Um estado epigenético normal é mantido numa célula, pelo menos em parte, através da metilação do ADN. Medir padrões de metilação aberrantes em ctDNA é possível devido à metilação estável de regiões de DNA referidas como “Ilhas CpG”. A metilação de ctDNA pode ser detectada através do tratamento com bissulfito. O tratamento com bissulfito converte quimicamente citosinas não-metiladas em uracilo, deixando as citosinas metiladas não-modificadas. O DNA é subsequentemente sequenciado, e quaisquer alterações ao padrão de metilação do DNA podem ser identificadas. A hidroximetilação do DNA é uma marca similarmente associada que tem sido mostrado ser um marcador preditivo de condições saudáveis versus doentes em cfDNA, incluindo câncer. Medindo padrões aberrantes de hidroximetilação em ctDNA tem sido provado por pesquisadores da Universidade de Chicago (Chuan He lab,) Universidade de Stanford (Quake lab,) e da empresa Cambridge Epigenetix.

approachesEdit

In a targeted approach, sequencing of ctDNA can be direct towards a genetic panel constructed on mutational hotspots for the cancer of interest. Isto é especialmente importante para informar o tratamento em situações em que as mutações são identificadas em alvos drogáveis. A personalização da análise orientada de ctDNA para cada paciente também é possível através da combinação de biópsias líquidas com biópsias de tecido primário padrão. O genoma completo ou sequenciamento completo da biópsia primária do tumor permite a descoberta de mutações genéticas específicas do tumor de um paciente, e pode ser usado para sequenciamento posterior direcionado do ctDNA do paciente. A maior sensibilidade da detecção de ctDNA é realizada através da sequenciação direcionada de polimorfismos de nucleótidos específicos (SNPs). Genes comumente mutados, tais como oncogenes, que tipicamente têm mutações hotspot, são bons candidatos para abordagens sequenciadas. Inversamente, a maioria dos genes supressores tumorais têm uma ampla gama de possíveis perdas de mutações de função em todo o gene, e como tal não são adequados para sequenciamento direcionado.

abordagens orientadas têm a vantagem de amplificar ctDNA através de reações em cadeia polimerase (PCR) ou PCR digital. Isto é especialmente importante ao analisar ctDNA não só porque há níveis relativamente baixos de DNA circulando na corrente sanguínea, mas também porque ctDNA constitui uma pequena proporção do total de DNA livre de células extraído. Portanto, a amplificação de regiões de interesse pode melhorar drasticamente a sensibilidade da detecção ctDNA. No entanto, a amplificação através da PCR pode introduzir erros dada a taxa de erro inerente das DNA polimerases. Erros introduzidos durante a sequenciação também podem diminuir a sensibilidade de detecção de mutações ctDNA.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

This method is derived from the digital PCR, originally named by Bert Vogelstein’s group at Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR utiliza um gerador de droplet para partição de pedaços de DNA em droplets usando uma emulsão óleo/água. Em seguida, as reacções individuais em cadeia da polimerase ocorrem em cada gota usando primers seleccionados contra regiões de ctDNA e prossegue até ao ponto final. A presença das sequências de interesse é medida por sondas fluorescentes, que se ligam à região amplificada. o ddPCR permite uma avaliação Altamente quantitativa das frequências alélicas e mutantes no ctDNA, mas é limitado pelo número de sondas fluorescentes que podem ser utilizadas num doseamento (até 5). A sensibilidade do ensaio pode variar dependendo da quantidade de ADN analisado e é de cerca de 1 em cada 10 000.

esférulas, emulsificação, amplificação e edição de Magnéticos (teletransporte)

esta técnica baseia-se em PCR Digital de gotículas, a fim de identificar mutações em ctDNA usando citometria de fluxo. Após a extracção do ctDNA do sangue, a PCR é realizada com iniciadores concebidos para atingir as regiões de interesse. Estes iniciadores também contêm sequências específicas de DNA, ou tags. O ADN Amplificado é misturado com esferas magnéticas revestidas de estreptavidina e emulsionado em gotículas. Os iniciadores biotinilados concebidos para se ligarem às etiquetas são utilizados para amplificar o ADN. A biotinilação permite que o ADN amplificado se ligue às esferas magnéticas, que são revestidas com estreptavidina. Após a PCR estar completa, as contas ligadas ao DNA são separadas usando um íman. O ADN nas contas é então desnaturado e autorizado a hibridizar com oligonucleótidos fluorescentes específicos a cada modelo de ADN. Os complexos bead-DNA resultantes são então analisados usando citometria de fluxo. Esta técnica é capaz de capturar alelos e frequências de mutação devido ao acoplamento com ddPCR. No entanto, ao contrário do ddPCR, um maior número de sequências de DNA pode ser interrogado devido à flexibilidade de usar sondas de ligação fluorescente. Outra vantagem deste sistema é que o DNA isolado também pode ser usado para sequenciamento a jusante. A sensibilidade é de 1, 6 em 104 a 4, 3 em 105.

CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)Edit

This method was originally described by Ash Alizadeh and Maximilian Diehn’s groups at Stanford University. Esta técnica utiliza sondas selectoras de oligonucleótidos biotinilados para obter sequências de ADN relevantes para a detecção de ctDNA. Bases de dados disponíveis publicamente sobre o cancro foram usadas para construir uma biblioteca de sondas contra mutações recorrentes no cancro, calculando o seu Índice de recorrência. O protocolo foi optimizado para os baixos níveis de ADN observados na colecção ctDNA. Depois, o ADN isolado passa por uma sequência profunda para aumentar a sensibilidade. Esta técnica permite o interrogatório de centenas de regiões de DNA. A sensibilidade de detecção de ctDNA de CAPP-Seq é relatada como sendo de 2,5 moléculas em 1.000.000.

sequenciação profunda AMplicon marcada (TAM-Seq)Edit

TAM-Seq permite sequenciamento direcionado de genes inteiros para detectar mutações em ctDNA. Primeiro uma etapa de amplificação geral é realizada usando iniciadores que abrangem todo o gene de interesse em seções de 150-200bp. Em seguida, um sistema microfluídico é usado para ligar adaptadores com um identificador único para cada amplificador para amplificar ainda mais o DNA em reações de singleplex paralelas. Esta técnica mostrou identificar com sucesso mutações espalhadas no gene supressor tumoral TP53 em pacientes com câncer de ovário avançado. A sensibilidade desta técnica é de 1 em 50.Este método foi originalmente descrito por Bert Vogelstein e seu grupo na Universidade Johns Hopkins. Safe-Seq diminui a taxa de erro de sequenciação massivamente paralela, a fim de aumentar a sensibilidade a mutantes raros. Consegue-o através da adição de uma sequência identificador único (UID) a cada modelo de ADN. O DNA é então amplificado usando UIDs adicionados e sequenciados. Todas as moléculas de ADN com a mesma UID (uma família UID) devem ter a mesma sequência de ADN relatada, uma vez que foram amplificadas a partir de uma molécula. Entretanto, mutações podem ser introduzidas através de amplificação, ou tarefas de base incorretas podem ser chamadas nos passos de sequenciação e análise. A presença da UID permite que estes erros de metodologia sejam separados de verdadeiras mutações da ctDNA. Uma mutação é considerada um “supermutante” se 95% das leituras sequenciadas estiverem de acordo. A sensibilidade desta abordagem é de 9 em 1 milhão.

Duplex sequencingEdit

this method is an improvement on the single UIDs added in the Safe-Seq technique. Em sequenciação duplex, DNA de cadeia dupla aleatória atuam como tags únicos e estão ligados a um espaçador invariante. As marcas estão ligadas a ambas as extremidades de um fragmento de ADN (marcas α e β), o que resulta em dois modelos únicos para a cadeia PCR – one com uma etiqueta α Na extremidade 5′ e uma etiqueta β Na extremidade 3′ e a outra cadeia com uma etiqueta β Na extremidade 5′ e uma etiqueta α Na extremidade 3′. Estes fragmentos de DNA são então amplificados com iniciadores contra as sequências invariantes das tags. O ADN Amplificado é sequenciado e analisado. O ADN com os adaptadores duplex são comparados e as mutações só são aceites se existir um consenso entre ambas as cadeias. Este método leva em conta tanto erros de sequenciação como erros de amplificação PCR em estágio inicial. A sensibilidade da abordagem à descoberta de mutantes é 1 em 10 ^ 7.

supressão integrada de erros digitais (iDES)-CAPP-seqedit melhorado

iDES melhora a análise CAPP-Seq de ctDNA, a fim de diminuir o erro e, portanto, aumentar a sensibilidade da detecção. Reported in 2016, iDES combines CAPP-Seq with duplex barcoding sequencing technology and with a computational algorithm that removes stereotypical errors associated with the CAPP-Seq hybridization step. O método também integra sequenciamento duplex sempre que possível, e inclui métodos para uma recuperação duplex mais eficiente do DNA livre de células. A sensibilidade desta versão melhorada do CAPP-Seq é de 4 em 100.000 cópias.