a aplicação do sistema Cobas 4800 para a detecção do Papilomavírus Humano de alto risco em 5650 Mulheres assintomáticas

Abstract

teste do papilomavírus de alto risco (HR-HPV) combinado com a citologia melhora a detecção de lesões do colo do útero e aumenta a duração dos intervalos de rastreio. Para uma pesquisa de HR-HPV baseada na população, a automação de testes é muito necessária. O Cobas 4800 HPV Test System é um teste totalmente automatizado que pode detectar simultaneamente HPV16, HPV18 e outros 12 genótipos HR-HPV agrupados. Este sistema tem sido empregado para o rastreio de HR-HPV em vários países; no entanto, tal aplicação numa grande população na China não foi documentada. Neste estudo, empregamos o sistema Cobas 4800 HPV para detectar HR-HPV em amostras de citologia cervical coletadas de um total de 5650 mulheres assintomáticas de uma região do Sul da China. Nós informamos o seguinte: (1) a prevalência de 14 genótipos de HR-HPV foi 12.96%; (2) para aqueles com HR-HPV a infecção, de 2,25% foram positivas para o HPV 16, de 0,50% para o HPV 18, 9.15% para o pool de 12 tipos de HPV, e de 1,06% para vários infecção por HPV; e (3) não houve diferença significativa na prevalência de HR-HPV entre os diferentes grupos etários. Hpv 16 e HPV 18 foi mostrado para ser a predominante tipos de HPV encontrados no câncer cervical de pacientes em algumas regiões da China, indicando que uma totalmente automatizada ensaio como o Cobas 4800 HPV Teste de Sistema é especialmente valioso para a população-base de HR-HPV de triagem, estas regiões como este ensaio pode detectar simultaneamente o hpv 16 e HPV 18.

1. Introdução o papilomavírus humano (HPV) é um vírus de DNA de cadeia dupla da família Papillomaviridae . Foram identificados mais de 200 genotipos de HPV, entre os quais: 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82) estão altamente associados ao cancro do colo do útero . O câncer Cervical é o quarto câncer mais comum em mulheres em todo o mundo e o sexto câncer mais comum em mulheres na China . Para reduzir o peso do cancro do colo do útero, a identificação precoce das lesões cervicais que provavelmente progridem para o cancro invasivo é de importância primordial. A citologia Cervical desempenha um papel importante na prevenção do cancro do colo do útero . A adição do teste do HPV à citologia resulta num aumento da detecção de lesões do colo do útero de alto grau, pelo que se recomenda que o rastreio de HPV de alto risco (HPV-HR) seja incorporado na citologia para melhorar a detecção da doença e aumentar a duração dos intervalos de rastreio .Até à data, foram notificados vários métodos para a genotipagem e detecção do HPV . Para a triagem baseada na população, a automação de testes é especialmente útil, uma vez que a automação possui a capacidade de processar um grande número de amostras em um curto espaço de tempo e reduzir erros humanos que podem ocorrer em operações manuais. The Cobas 4800 HPV Test System (Roche Molecular Systems Inc., Rotkreuz, Suíça), totalmente automatizado, é projetado para, simultaneamente, detectar um total de 14 HR-HPV tipos: HPV 16 individualmente, HPV 18 individualmente, e 12 pool de RH-genótipos de HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68) . Este sistema foi aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA para rastreio de HPV-HR. O sistema Cobas 4800 do teste do HPV consiste em 2 partes, i.e., a Cobas x 480 Instrument that is used for automation of nucleic acid purification and PCR sample pipetting and a Cobas z 480 Analyzer that is for automatic real-time PCR amplification and subsequent type-specific hybridization. Embora a utilização do sistema Cobas 4800 para o teste do HPV-HR tenha sido notificada em vários países , tal aplicação numa grande população na China não foi documentada. Neste estudo, empregamos o sistema Cobas 4800 HPV para detectar HR-HPV em amostras de citologia cervical coletadas de um total de 5650 mulheres assintomáticas.

2. Métodos

este estudo foi aprovado pela Comissão Médica de revisão do Hospital Zhongshan da Medicina Tradicional Chinesa. Foi obtido consentimento informado de todos os participantes.

2.1. A colheita de amostras cervicais

mulheres assintomáticas com idades entre os 20 e os 65 anos foi incluída entre janeiro de 2018 e dezembro de 2018 para este estudo com o custo dos testes coberto por indivíduos do estudo ou seus empregadores ou em combinação. Os critérios de inclusão incluem ser 20 anos ou mais, não estar grávida, ter útero intacto, ser sexualmente ativo, ou ter Histórico de atividade sexual. Todos os indivíduos foram informados de não usar medicamentos vaginais, contraceptivos vaginais ou lubrificantes durante 48 horas antes da amostragem cervical. As amostras de citologia Cervical foram recolhidas utilizando o dispositivo Combi Cervex-Brush (dispositivos médicos Rovers) do seguinte modo: a parte de amostragem endocervical do dispositivo foi inserida no canal endocervical para permitir que as cerdas laterais contactassem completamente o ectocervix, e o dispositivo foi então rodado duas voltas completas no Sentido DOS ponteiros do relógio. Após a retirada, o dispositivo com as células colhidas foi imediatamente inserido num frasco para injectáveis contendo Conservencyt solução (Halic Inc., Bedford, MA, EUA) e girou vigorosamente. Foram utilizadas amostras para detecção do ADN do HPV, conforme descrito abaixo.

2.2. Detecção de HR-HPV utilizando o sistema Cobas 4800 de teste do HPV

Tampão de Lise, Tampão de lavagem, Tampão de eluição, Kits de controlo positivo e negativo do HPV, e todos os outros reagentes foram comprados à Roche Molecular Systems Inc. Cada amostra tinha um controle interno, β-globina, para monitorar a adequação das células, e cada execução incluiu um conjunto de controles positivos e negativos do HPV. A extração e purificação do DNA foram feitas com o instrumento Cobas x 480 de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras de solução de Conservcyt foram indexadas e colocadas no porta-amostras, e os reagentes, por exemplo, Tampão de Lise, Tampão de lavagem e tampão de eluição, foram carregados nos respectivos porta-reservatórios de reagente. Após o carregamento da amostra e do reagente, a preparação de ADN foi concluída automaticamente e os produtos finais de ADN foram recolhidos numa placa de microwell. Subsequentemente, a placa de microwell contendo DNA foi selada manualmente e carregada no analisador Cobas z 480, e a amplificação e hibridação foram completadas automaticamente.

2.3. Análise estatística

análise estatística foi realizada usando SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA). O teste χ2 foi usado para avaliar variáveis categóricas. Todos os testes estatísticos foram de 2 lados, e valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

3. Resultados

um total de 5650 mulheres assintomáticas com idade entre 20 e 65 anos com idade média de anos cumpriram a exigência do estudo e foram incluídas neste estudo. Destes participantes, 732 (12.96%) foram detectados como HR-HPV-positivos, incluindo 127 (2.25%) com infecção por hpv 16, 28 (0.50%) com HPV 18, 517 (9.15%), com pool de 12 tipos de HPV, e 60 (de 1,06%) com vários infecção por HPV (HPV 16 misturado com o HPV 18, HPV 16 misto com 12 pool tipos de HPV 18 misto com 12 pool tipos de hpv 16 ou misturado com HPV 18 e 12 pool tipos de) (Tabela 1).

de Acordo com a idade, os participantes foram divididos em 4 grupos: 20-30, 31-40, 41-50, e >51 anos. Como demonstrado na Tabela 2, o grupo dos 31-40 anos apresentou a taxa de infecção por HPV HR mais elevada de 15, 32%, seguida pelos grupos de >50 anos, 41-50 anos e 20-30 anos, embora não tenha sido observado significado estatístico entre as taxas de infecção destes grupos.

4. Discussão

neste estudo, foi utilizado o Cobas 4800 Sistema para detectar HR-HPV em 5650 mulheres assintomáticas e descobriu o seguinte: (1) a prevalência de 14 genótipos de HR-HPV foi 12.96%; (2) de 732 HR-HPV-positivos mulheres, de 2,25% foram positivas para o HPV 16, de 0,50% para o HPV 18, 9.15% para o pool de 12 tipos de HPV, e de 1,06% para vários infecção por HPV; e (3) não houve diferença significativa na prevalência de HR-HPV entre os diferentes grupos etários.

tanto o teste de alto risco para o HPV em tempo real do Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, USA) e o sistema Cobas 4800 HPV Testing System são testes clinicamente validados, totalmente automatizados baseados em PCR para a detecção de HR-HPV . Uma vantagem destes dois testes é que eles podem detectar e distinguir simultaneamente HPV16 e HPV18, o que é importante para o rastreio do câncer cervical, pois HPV16 e HPV18 são responsáveis por aproximadamente 70% dos cancros cervicais globalmente . Poucos estudos compararam estes 2 ensaios na detecção do HPV-HR em amostras clínicas. Park et al. testado 365 espécimes de esfregaço cervical e informou que o tempo real de Alto Risco do HPV Teste apresentou uma sensibilidade de 78.3%, com uma especificidade de 99,2%, enquanto que a sensibilidade e a especificidade do Cobas 4800 Sistema foram 91.7% e 97,0%, respectivamente . Cuzick et al. 6000 mulheres examinadas e revelaram que 16, 0% foram detectadas como HR-HPV-positivas pelo sistema Cobas 4800, enquanto 13, 4% foram detectadas como HR-HPV-positivas pelo teste de HPV de alto risco em tempo real . Estes dados indicam que o sistema Cobas 4800 possui maior sensibilidade à detecção.

vários sistemas moleculares clinicamente validados para a detecção do ADN HPV-HR foram incluídos pela Organização Mundial da Saúde em 2016 no manual Integrating HPV Testing in Cervical Cancer Screening Programs-um Manual para gestores de Programas (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Estes testes consistem em ensaios baseados em hibridação, ou seja, a técnica de captura Híbrida 2 e o teste CareHPV, e testes baseados em PCR, e.g., o teste Cobas HPV, o teste Abbott RealTime High Risk HPV test, O teste Cervista HPV HR, e o teste BD HPV. Todos os ensaios baseados em PCR requerem isolamento de ADN, enquanto os ensaios baseados em hibridação não. De todos os métodos, o teste de HR do HPV Cervista leva 6-7 horas e o teste de alto risco do HPV Abbott leva 6-8 horas para ser executado, o que pode não cumprir o objetivo de “ver e tratar” no mesmo dia. Em contraste, todos os métodos de descanso, incluindo o sistema Cobas 4800, no entanto, requerem um tempo máximo de execução de aproximadamente 5 horas, adequado para os pacientes para completar “ver e tratamento” em uma visita.

globalmente, a prevalência de HPV-HR varia de continente para continente . Na China, para o levantamento da prevalência de HR-HPV, foram utilizados diferentes métodos . Wu et al. empregados a Captura Híbrida 2 Ensaio (Qiagen, Hilden, Alemanha) para a detecção de HR-HPV, de 13 de pool tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, e 68), em um total de 4215 mulheres com idade 17-54 anos, a partir de 5 diferentes áreas geográficas da China e descobriram que o HR-HPV prevalência foi de 12,4% . Usando o mesmo método que Wu et al. , Zhao et al. encontrei 15.2% das 1274 mulheres de uma região no norte da China foram positivas para o HPV-HR . Chen et al. empregou um Kit de genotipagem do HPV (Yaneng Biotechnology Limited Corp., Shenzhen, China) para um total de 961,029 testes de HPV para mulheres com idades entre 16 e 83 anos a partir do Sudeste Da China e revelou uma taxa de infecção pelo HPV-HR de 16,61% . Jing et al. aplicou um ensaio espectrométrico de massa para o teste do ADN do HPV em 78 .355 mulheres com idades compreendidas entre os 18 e os 75 anos do Sul da China e notificou uma taxa de prevalência de HPV <7, 3% HR. Estes estudos demonstram uma taxa de infecção por HR-HPV que varia entre aproximadamente 10-15% em mulheres chinesas, o que está de acordo com a nossa descoberta. No entanto, o método que usamos no presente estudo é mais simples e menos trabalhoso em comparação com os utilizados em investigações anteriores .Dois estudos com a maior dimensão da amostra realizada na China compararam as taxas de prevalência de HPV-HR entre os grupos etários. Zeng et al. analisaram retrospectivamente os testes de HPV 671.163 realizados utilizando o método híbrido Capture 2 de 2007 a 2014 e demonstraram a maior prevalência de HPV-HR de 36.9% no grupo etário <20 anos, enquanto o HR-HPV-positivo taxas para os grupos etários de 20-30, 30-40 e 40-50 anos foram de 24,4%, 19,7% e 19,9%, respectivamente . Teste HR-HPV com o maior tamanho da amostra (961,029 amostras) realizado por Chen et al. mostra novamente a mais alta taxa de prevalência de HR-HPV no grupo etário <20 anos (22.3%), enquanto as taxas de prevalência para os grupos etários de 20-30, 30-40 e 40-50 anos são de 16,8%, de 15,2% e 15,9%, respectivamente . Estes estudos revelam uma taxa de prevalência ligeiramente superior no grupo de 20-30 anos do que nos grupos de 30-40 e 40-50 anos, o que está em contraste com os nossos resultados, já que observamos a menor prevalência de HR-HPV no grupo de 20-30 anos. Esta discrepância pode ocorrer devido aos seguintes fatores: (1) as mulheres mais jovens têm hoje mais acesso a programas de educação em saúde, especialmente os programas on-line utilizando dispositivos eletrônicos, e (2) as mulheres mais jovens estão mais ansiosos para aprender e aceitar novos conhecimentos sobre saneamento e saúde sexual.

HPV 16 é o tipo mais comum de HR-HPV encontrados em amostras cervicais de mulheres do Norte (Pequim e Henan, Shanxi, e Províncias de Xinjiang), Sudeste (de Xangai e a Província de Zhejiang), e do Sul da China (Província de Guangdong) regiões, com uma taxa positiva variando de 1,5 a 3,6% , o que está em linha com um 2,25% HPV 16 taxa de infecção observados em nosso estudo de assuntos que são do Sul da China. HPV16 é responsável por aproximadamente 50% do câncer cervical globalmente . Embora a informação sobre a distribuição do genótipo HR-HPV nos doentes com cancro do colo do útero Chinês seja ainda limitada, Li et al. foi relatado que 1818 de 2309 doentes com cancro do colo do útero (78, 7%) da China ocidental foram positivos para HPV16, e aproximadamente 90% destes doentes foram positivos para HPV16 e HPV18 . Uma taxa de infecção de 53, 2% para HPV16 e HPV18 foi também demonstrada em 326 doentes com cancro do colo do útero da província de Fujian, no Sudeste Da China . Estes dados indicam que HPV16 e HPV18 são os tipos predominantes de HPV encontrados em doentes com cancro do colo do útero nestas regiões. Um ensaio totalmente automatizado, como o Cobas 4800 HPV Test System, que pode simultaneamente detectar e diferenciar HPV16 e HPV18, será especialmente valioso para o rastreio de HPV-HPV baseado na população em regiões que têm uma dominância de infecção HPV16 e HPV18.

disponibilidade de dados

os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis A pedido do autor correspondente.

conflitos de interesses

os autores declaram que não têm conflitos de interesses.

contribuições dos autores

SW, XH, QP e LZ recrutaram os participantes, recolheram amostras e realizaram testes. SW e JZ escreveram o artigo. FM revisou a literatura e realizou análises estatísticas. A JZ projetou o estudo, analisou os dados e finalmente aprovou o manuscrito.