Background: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) has a classic immunophenotype, consisting of light chain restriction, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – and CD79b-. Isto distingue-o das células B normais e de outros distúrbios linfoproliferativos (LPDs). Anticorpos contra estes antigénios estão incluídos em dois painéis de citometria de fluxo de 8 cores desenvolvidos pelo Consórcio Euroflow para o trabalho de LPDs de células B. Combinar estes anticorpos em um painel de 10 cores seria mais rentável. Além disso, novas terapias LLC podem induzir remissões profundas, criando uma demanda crescente para medir a doença residual mínima (MRD), definida como tendo mais de 1 célula leucêmica residual por 10.000 leucócitos (10-4). A actual abordagem internacional normalizada para medir o MRD, estabelecida pela Iniciativa Europeia de investigação sobre a LLC (ERIC), utiliza um painel de anticorpos direccionado para CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b e CD81. No entanto, estas combinações anticorpo-fluorocromo são diferentes das utilizadas pelos painéis de diagnóstico Euroflow. Assim, os laboratórios que estão a considerar a implementação de testes de MRD precisariam de comprar anticorpos para 3 painéis diferentes (2 diagnósticos e 1 MRD). Expandimos o tubo de triagem linfócito de 8 cores do Euroflow (LST) para incluir CD200 e CD23, de modo que a LLC pode ser detectada em um tubo de 10 cores, em níveis tão baixos quanto 0,01%. O objetivo deste estudo era determinar as potenciais economias de custos na implementação deste novo painel e determinar se ele é sensível o suficiente para detectar MRD.Métodos
: calculamos o número de amostras analisadas com o nosso tubo LST de 10 cores modificado (mLST1, obtido liofilizado) de abril de 2018 A Março de 2019 para excluir um LPD e o número de alíquotas de anticorpos salvos usando esta abordagem em comparação com o Método Padrão de fluxo Euroflow de 2 tubos. Também criamos uma versão do painel acima mencionado (mLST2) usando anticorpos líquidos para aumentar a generalização de nossos resultados, substituindo CD38 com CD43 para ver se isso melhorou a detecção de MRD (ver painéis abaixo). Para testes de MRD, usamos amostras de CLL de 24 pacientes diferentes para produzir 60 amostras de MRD em várias concentrações de células leucêmicas. As amostras foram preparadas através da adição de células LLC em suspensões de leucócitos normais em concentrações aproximadas de 0, 1%, 0, 01% e 0, 001%. Cada amostra foi aliquotada e manchada com os três painéis: ERIC, mLST1 e mLST2. Os dados foram adquiridos através de uma fusão BD FACSCanto II ou BD FACSAria e analisados através de software BD FACSDiva. As células LLC foram identificadas com base na expressão diferencial dos marcadores chave e a MRD foi calculada como o número de células LLC/leucócitos totais. A positividade MRD foi definida como ≥ 0, 01%. O Acordo entre os painéis foi avaliado utilizando o método Bland-Altman plot. Calculámos também o acordo percentual entre os painéis para identificar a positividade do MRD.Resultados
: em 1 ano, o mLST1 foi realizado em 474 amostras, destas 220 tinham um LPD e 123 (56%) tinham um fenótipo CLL clássico, obviando a necessidade de mais testes. Isto resultou na poupança líquida de 476 alíquotas de anticorpos. Para a avaliação do MRD, a expressão diferencial do CD5 e do CD20 foi a contribuição mais significativa para distinguir a LLC das células B normais utilizando o mLST1 e o mLST2. Identificámos um caso de LLC com um imunofenótipo atípico (dim CD5, bright CD20) que se revelou difícil de detectar usando um painel mLST. Os resultados obtidos com os painéis mLST e o painel ERIC chegaram a acordo. Para valores acima do limite de quantificação, o limite de acordo de 95% foi de ±0, 3369 log para a comparação ERIC vs mLST1 e de ±0, 3485 log para a comparação ERIC vs mLST2. Assim, a variabilidade nos níveis de MRD entre os painéis foi inferior a 2 vezes a maioria do tempo, que nós consideramos clinicamente aceitável como MRD é medido em uma escala exponencial. O painel ERIC e o mLST1 tinham 88,3% de acordo na distinção entre amostras MRD-positivas e MRD-negativas. O Acordo foi de 93,3% entre o painel ERIC e o mLST2.
conclusões: a utilização de um painel LST de 10 cores modificado para diagnóstico e medição de MRD de llc é viável. As vantagens são uma maior familiaridade com os anticorpos e potenciais economias de custos, tornando MRD Acessível a mais laboratórios de citometria. Casos atípicos de LLC sem a positividade CD5 habitual e CD20 dim são muito difíceis de abrir usando um painel LST. Nestes casos, o painel ERIC é claramente superior, já que CD22, CD79b, CD81 e CD43 ainda podem fornecer separação entre os linfócitos malignos e normais.
Bazinet: Biociências BD: outros: desde que uma quantidade significativa dos anticorpos utilizados neste projecto seja isenta de custos.. Wever: Teva Canada Innovation: Emprego. Gimmig: BD Biosciences: Employment. Johnson:Lundbeck: Emprego, Honorários, Membros de uma entidade Conselho de Administração ou comitê consultivo, Outros: taxas de Viagens, presentes, e outros, o Financiamento da Investigação; Merck: Consultoria, Honorários; Roche: Consultoria, Emprego, Honorários, Membros de uma entidade Conselho de Administração ou comitê consultivo, Outros: taxas de Viagens, presentes, e outros, o Financiamento da Investigação; Abbvie: Consultoria, Emprego, Honorários, Membros de uma entidade Conselho de Administração ou comitê consultivo, o Financiamento da Investigação; BD Biosciences: Outros: Forneceu uma proporção significativa dos anticorpos utilizados neste projecto, sem custos.; BMS: Consultancy, Honoraria; Seattle Genetics: Honoraria.