Única mutação em um altamente conservado da região de cloranfenicol acetyltransferase permite que o acetato de isobutil directamente na produção de celulose por Clostridium thermocellum em temperaturas elevadas

estirpes Bacterianas e plasmídeos

estirpes Bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela 2. Clostridium thermocellum DSM1313 ∆hpt (M1354) estirpe foi utilizada como um hospedeiro para a produção de éster a temperaturas elevadas. Deve ser destacado que a exclusão de hypoxanthine phosphoribosyltransferase (gene hpt, Clo1313_2927) no tipo selvagem DSM1313 permite que a engenharia genética por 8-azahypoxanthine (8-AZH) contador de seleção; esta exclusão não têm nenhum efeito adverso no crescimento celular e metabolismo . O plasmid pNW33N, contendo CATSa, é termostável e foi usado para expressar vários gatos em C. thermocellum. Os plasmídeos de pET foram usados para clonagem molecular e expressão enzimática em E. coli.

produtos Químicos e reagentes

Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (MO, EUA) e/ou Thermo Fisher Scientific (MA, EUA), a menos que especificado em outro lugar. Para a clonagem molecular, foram obtidas enzimas de restrição e ligase T4 da New England Biolabs (MA, EUA). Phusion Hot Start II DNA polymerase was used for polymerase chain reaction (PCR).

meios e cultivo

para clonagem molecular e expressão proteica, as estirpes de E. coli foram cultivadas em caldo lisogénico (LB) contendo antibióticos adequados, salvo indicação em contrário. Para a caracterização in vivo da CATSa na E. coli, foi utilizado um meio híbrido M9 com glucose a 20 g/l. Para a cultura de C. thermocellum, o meio mínimo MTC ou meio CTFuD-NY foi usado conforme especificado nos experimentos. A densidade óptica (OD) foi medida por um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA).

Análise de alinhamento de sequências múltiplas

análise de alinhamento de sequências múltiplas (MSA) foi realizada usando MEGA7 . Sequências de proteínas foram alinhadas por ClustalW e visualizadas por ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . As principais características das estruturas proteicas de 3U9F , 4CLA e 2XAT foram extraídas de CAT_SALTI , CAT3_ECOLIX e CAT4_PSEAE, respectivamente.

modelagem Molecular de ligação e simulações

tridimensional (3D) das estruturas

A estrutura 3D de CATSa e álcoois de interesse foi gerada usando o Swiss-Model e o ‘Construtor’ ferramentas de MOE (Molecular Ambiente Operacional do software, versão 2019.01), respectivamente. A estrutura 3D do complexo de CATSa com substrato duplo (isto é, acetil-CoA–isobutanol–CATSa) foi obtida extraindo um isobutanol do complexo isobutanol–CATSa e adicionando-o ao complexo acetil–CoA-CATSa. Todas as estruturas foram preparadas pela ferramenta “QuickPrep” do MOE com parâmetros padrão e otimizadas pela minimização de energia com o campo de força Amber10:EHT.

simulação de acoplagem

para realizar simulações de acoplagem, o potencial bolso de ligação foi pesquisado usando a ferramenta “Localizador de Site” de MOE. O local mais bem pontuado, consistente com os locais catalíticos relatados , foi selecionado para estudos adicionais. Simulações de acoplagem foram realizadas como descrito anteriormente . Brevemente, acetil-CoA e cada álcool foram acoplados usando o protocolo de ajuste induzido com o método de colocação de Matchers Triangle e a função de pontuação ΔG de Londres. Após as simulações de acoplagem, foi selecionada a pose de ligação mais bem pontuada, mostrando a interação crucial entre o resíduo e o substrato no desvio quadrático-médio-quadrado (RMSD) < 2 Å. Como exemplo, para a acoplagem acetil-CoA, a posição de ligação exibindo a ligação de hidrogênio entre o hidroxilo de Ser-148 e o N71 do CoA foi escolhido . Para a acoplagem de álcool, a pose de ligação mostrando a ligação de hidrogênio entre o n3 de His-189 e o hidroxilo de álcool foi selecionado .

na análise de mutagénese sílica foi efectuada a análise de mutagénese sílica do complexo acetil-CoA–isobutanol–CATSa, tal como anteriormente descrito . Especificamente, as ferramentas de “análise de alanina” e de “análise de resíduos” do MOE foram utilizadas para identificar os potenciais candidatos a resíduos de mutagénese.

clonagem Molecular

construção de plasmídeos

plasmídeos foram construídos pela técnica padrão de clonagem molecular do método dependente da ligase e / ou Montagem Gibson usando os iniciadores listados no arquivo adicional 1: Tabela S1. Os plasmídeos construídos foram introduzidos no TOP10 de E. coli por transformação de choque térmico. As colónias isoladas numa placa selectiva foram rastreadas por PCR e purificadas por plasmídeo. Os plasmídeos purificados foram verificados através da sequenciação de Sanger antes de serem transformados em E. coli BL21 (DE3). A mutagénese no local foi realizada utilizando o protocolo de mutagénese no local de QuickChange™ com menor comprimento de sobreposição ou Método de montagem Gibson . Para a C. thermocellum engineering, o phs005 plasmídeo foi construído primeiro e depois modificado para pHS0024. pHS0024 não tem hpt a jusante do operão, enquanto outras sequências do plasmídeo são idênticas ao pHS005.

transformação

os métodos convencionais de transformação química e electroporação foram utilizados para a transformação de E. coli e C. thermocellum , respectivamente. Para C. thermocellum, the method, however, was slightly modified as described here. Primeiro, C. thermocellum M1354 (Tabela 2) foi cultivado em 50 mL de meio CTFuD-NY a 50 °C dentro de uma câmara anaeróbica (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., OU, EUA). A cultura celular com OD em um intervalo de 0.8–1.0 foi resfriada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Além deste ponto, todos os passos foram realizados fora da Câmara. As células arrefecidas foram colhidas a 6500×g e a 4 ° C durante 20 minutos. Os pellets celulares foram lavados duas vezes com água Mili-Q refrigerada e ressuspendidos em 200 µL do tampão de transformação constituído por 250 mM de sacarose e 10% (v/v) de glicerol. Várias alíquotas de 30 µL das células electrocompetentes foram imediatamente armazenadas a-80 °C para posterior utilização. Para a electroporação, as células electrocompetentes foram descongeladas e incubadas com 500-1000 ng de plasmídeos metilados durante 10 minutos. Em seguida, as células foram transferidas para uma cuveta de eletroporação de 1 mm gelada (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) seguida por dois pulsos de decaimento exponencial consecutivos com 1.8 kV, 350 Ω e 25 µF. Os pulsos geralmente resultaram em uma constante de tempo de 7,0–8,0 ms. As células foram imediatamente ressuspendidas em CTFuD-NY fresco pré-aquecido e recuperadas a 50 ° C em condições anaeróbias (90% N2, 5% H2 e 5% CO2) dentro de um tubo de Bálcamo coberto de borracha. Após 0-12 h de recuperação, as células foram misturadas com meio de ágar CTFuD-NY derretido, complementado com 15 µg/mL de tianfenicol. Por último, verteu-se a mistura de células médias numa placa de petri e solidificou-se no interior da Câmara anaeróbica. A placa foi incubada a 50 ° C até 1 semana até as colónias aparecerem. A eficiência de transformação foi de 2 a 100 unidades formadoras de colónias por µg de plasmídeo (UFC/µg plasmídeo).

In vivo caracterização de CATSa e suas variantes, como a E. coli

Para in vivo caracterização de CATSa e suas variantes, como E. coli, de alta densidade celular culturas foram realizados conforme descrito anteriormente, com a adição de 2 g/L de vários álcoois. Para a extracção in situ de ésteres, cada tubo foi sobreposto com 25% de hexadecano (v/v). Para confirmar a expressão proteica da CATSa e das suas variantes, 1% (v/v) de células-mãe foram cultivadas durante a noite a 37 °C e 200 rpm em tubos de cultura de 15 mL contendo 5 mL de meio LB e antibiótico. Em seguida, 4% (v/v) das culturas nocturnas foram transferidas para 1 mL de meio LB contendo antibiótico numa microplaca de 24 alvéolos. As culturas foram cultivadas a 37 ° C E 350 rpm usando um agitador de microplacas em incubação (Fisher Scientific, PA, EUA) até a do atingir 0.4–0.6 e, em seguida, induzido por 0.1 mM de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para 4 h com uma membrana de vedação fácil de respirar para evitar a evaporação e contaminação cruzada (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, EUA). As amostras de proteínas foram obtidas utilizando o reagente B-PER completo (cat # 89822, Thermo Scientific, MA, USA), de acordo com as instruções do fabricante e analisadas pela SDS-PAGE.

caracterização enzimática

purificação da sua marca

para expressão enzimática, uma cultura nocturna foi inoculada com uma 1:50 relação em meio LB fresco contendo 1 mM de IPTG e antibiótico, seguida de incubação de 18 °C durante a noite (até 20 h) numa incubadora agitada a 200 rpm. As células induzidas foram colhidas por centrifugação a 4 ° C e 4700×g durante 10 minutos. O sedimento celular foi então lavado uma vez com água de Millipore e ressuspendido no reagente B-PER completo. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada a 17.000×g durante 2 minutos. O sobrenadante foi recolhido e designado como extracto bruto. Para sua purificação, o extrato bruto foi incubado com agarose de SuperFlow HisPur Ni–neta em um lote, como o fabricante recomenda. Em seguida, a resina foi lavada com, pelo menos, três volumes de tampão de lavagem, constituído por 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol e 0,1 mM EDTA. As proteínas ligadas à resina foram eluídas por 300 µL de tampão de eluição contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 300 mM imidazol e 0,1 mM EDTA. A amostra eluída foi então dessalinizada e concentrada através de uma coluna de filtro de Amicon com um corte de 10 kDa de peso molecular. Por último, a amostra de proteínas foi suspensa em 200 µL de tampão Tris–HCl de 20 mM (pH 8.0). A concentração de proteínas foi determinada pelo ensaio de Bradford com a albumina sérica bovina (ASC) como proteína de referência.

ensaio de mudança térmica

para medir a temperatura de fusão das proteínas (Tm), foi utilizado um ensaio de termofluor com SYPRO Orange . Cerca de 10-250 µg de sua etiqueta proteína purificada foi misturada com 5× SYPRO laranja em um volume final de 50 µL em uma placa qPCR de 96 poços. A placa foi selada com tampas PCR antes de executar o ensaio. O StepOne em tempo real máquina de PCR (applied Biosystems, CA, EUA) foi utilizado para executar o ensaio com os seguintes parâmetros: ROX repórter, 1 °C de incremento por ciclo, 1-min mantenha em cada ciclo, e faixa de temperatura de 20 a 98 °C. Os dados foram coletados, exportados, e processados para calcular Tm.

5,5′ – ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) o ensaio

a taxa de reacção para cada gato foi determinada por um ensaio DTNB numa placa de 384 alvéolos. O volume Total da reacção foi de 50 µL com o tampão de reacção constituído por 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). As concentrações de acetil-CoA (Biosciências de CoALA, TX, EUA) e de álcoois variaram conforme especificado em cada experiência. Foram utilizadas concentrações enzimáticas finais de 0, 05 µg/mL e 10 µg/mL para as reacções a cloranfenicol e álcoois, respectivamente. A cinética de reacção foi recolhida medindo a absorvância a 412 nm por minuto durante 1 h a 50 ° C num leitor microplado (Synergy HTX microplate reader, BioTek). A taxa de reação foi calculada usando o coeficiente de extinção de uma curva padrão de coenzima livre a (MP Biomedicals, Oh, EUA) sob a mesma condição. Note-se que, uma vez que a temperatura máxima de funcionamento recomendada para o leitor de placas é de 50 °C, O ensaio enzimático de alta capacidade para CAT a temperaturas elevadas só foi realizado para determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos.

Calculation of kinetic parameters for reaction rates

the parameters of Michaelis-Menten rate law (Eq. 1) foram calculados para cada enzima da seguinte forma. Em primeiro lugar, a regressão linear foi realizada em dados recolhidos de um leitor microplaca para identificar as taxas de reacção iniciais, \(y_{I}\), em diferentes concentrações iniciais de substrato, \(s_{I}\), em que i = {1,2,…, n} é o número de pontos de dados recolhidos. Em seguida, essas taxas de reação iniciais e as concentrações iniciais associadas de substrato para todas as replicados foram simultaneamente adequados ao modelo Michaelis-Menten (Eq. 1) utilizando regressão robusta não linear (NQA. 2) com um estimador suave-L1-perda (Eq. 3) Como implementado na biblioteca de computação numérica SciPy v1. 2. 0 :

O de mínimos quadrados problema determina os parâmetros \(K_{\text{M}}\) e \(v_{ \text{máx} }\), minimizando a diferença entre o modelo previu taxas de reação \(v_{i}\) e medidos por taxas de reação \(y_{i}\) (Eq. 2). Uma função de suavização \(\rho \esquerda( z \direita)\) é usada para tornar o problema menos quadrado resistente a valores anómalos (Eq. 3). Devido à resistência imparável a valores anómalos e à prevenção de erros resultantes de métodos convencionais de linearização, a regressão não linear robusta fornece a estimativa de parâmetros mais precisa para o modelo Michaelis-Menten .A produção de acetato de isobutilo em C. thermocellum

fermentação de celobiose

produção de acetato de isobutilo a partir de celobiose em C. estirpes de termocellum foi realizada pela configuração de bioconversão em duas fases. As células foram primeiro cultivadas em meio mínimo MTC contendo 5 g/L de celobiose em um tubo de bálsamo de borracha tampado até OD atingir 0, 8–1.0. As células foram arrefecidas à temperatura ambiente durante 20 minutos e centrifugadas a 4700×g e a 4 °C durante 20 minutos. Após remoção do sobrenadante, as células foram ressuspensas no mesmo volume de meio mínimo MTC fresco contendo 2 g/L de isobutanol numa câmara anaeróbica. A suspensão celular foi então dividida em 800 µL num tubo de microcentrifugação com tampa roscada de 2, 0 mL, com uma sobreposição de hexadecano de 200 µL. As células foram incubadas a 55 ° C durante 24 h, seguindo-se a análise da cromatografia em fase gasosa associada a um espectrómetro de massa (GC/MS) para quantificar a quantidade de acetato de isobutilo produzido.

fermentação de celulose

para a fermentação de celulose, foi utilizado o meio MTC modificado (meio C-MTC). 20 g/L de Avicel PH-101 foi usado como uma única fonte de carbono em vez de celobiose, e 10 g / L de MOPS foi adicionado para aumentar a capacidade tampão. O pH inicial foi ajustado para 7,5 por 5 M KOH e autoclavado. Numa câmara anaeróbica, inocularam-se 0, 8 mL de cultura celular overnight em 15, 2 mL de meio C-MTC (razão de inoculação 1:20) com 4 mL de hexadecano sobreposto. Cada tubo continha uma pequena barra de agitador magnético para homogeneizar a celulose. O tubo de bálsamo com tampa de borracha foi incubado num banho de água ligado a um controlador de temperatura a 55 °C e a um sistema de agitação magnética. Após ajuste do pH com 70 µL de injecção de 5 M KOH, foram amostrados 800 µL de cultura celular e 200 µL de camada de hexadecano a cada 12 h. O pH de Cultura foi mantido dentro de um intervalo de 6.4–7.8 durante a fermentação. O crescimento das células foi monitorizado através da medição da proteína pellet. O sedimento celulósico de 800 µL de amostras foi lavado duas vezes com água Mili-Q e suspenso por 200 µL de tampão de lise (0.2 M NaOH, 1% SDS) seguida de uma incubação à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi neutralizada com 50 µL de HCl 0,8 M e diluída com 550 µL de água. A mistura foi centrifugada a 17.000×g durante 3 minutos. A concentração de proteínas do sobrenadante foi analisada pelo ensaio Bradford compatível com detergente (Thermo Scientific, WA, EUA). O sedimento residual foi cozido num forno a 98 ° C durante uma hora antes de quantificar a celulose residual.

a celulose Residual foi quantificada pelo método do ácido fenol-sulfúrico com algumas modificações. A amostra fervida foi lavada duas vezes com água Milli-Q e suspensa em 800 µL de água para obter um volume equivalente ao original. A amostra foi homogeneizada por tubagem e vórtice durante 10 s e 20 µL da amostra homogeneizada foi transferida para um novo tubo de microcentrifugação de 2,0 mL ou placa de 96 alvéolos e seca durante a noite numa estufa a 55 °C. O sedimento seco foi suspenso em 200 µL de ácido sulfúrico a 95% e incubado durante uma hora à temperatura ambiente. Após a dissolução completa do sedimento, adicionaram-se 20 µL de 5% de fenol e misturaram-se com a solução de ácido sulfúrico. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, transferiram-se 100 µL da amostra para uma nova placa de 96 alvéolos, medindo-se a absorvância a 490 nm. A absorvância foi convertida em concentração de celulose pela curva padrão de Avicel PH-101 tratada pelo mesmo procedimento.Os métodos analíticos

cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)

metabolitos extracelulares foram quantificados utilizando um sistema de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, USA). Centrifugou-se 800 µL de amostras de cultura a 17 000×g durante 3 minutos e, em seguida, filtrou-se os sobrenadantes através de filtros de 0,2 µm e executou-se com uma fase móvel de 10 mN H2SO4 a 0,6 mL/min num Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) column at 50 ° C. Refractive index detector (RID) and ultra-violet detector (UVD) at 220 nm were used to monitor concentrations of sugar, organic acids, and alcools.Cromatografia em fase gasosa associada a espectroscopia de massa (GC/MS)

ésteres foram medidos por GC (HP 6890, Agilent, CA, EUA) equipado com um MS (HP 5973, Agilent, CA, EUA). Para o sistema GC, a coluna capilar Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, EUA) (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm) foi usada para separar os analitos, e o hélio foi usado como portador com um caudal de 0.5 mL/min. A temperatura do forno programa foi definido da seguinte forma: 50 °C temperatura inicial, 1 °C/min rampa até 58 °C, 25 °C/min rampa até 235 °C, 50 °C/min rampa até 300 °C e 2 min a asse-as em 300 °C. 1 µL de amostragem hexadecane camada foi injetado na coluna no modo splitless com um injetor temperatura de 280 °C. Para o MS, sistema de íon selecionado (modo SIM) foi utilizada para detectar e quantificar ésteres com os seguintes parâmetros: (i) o acetato de etilo, m/z 45,00 e 61.00, de 4,2 para 4,6 min o tempo de retenção (RT), (ii) isopropílico acetato, m/z 45 e 102 de 4,7 5,0 min RT, (iii) propil acetato, m/z 59 e 73 de 5,2 a 5,8 min RT, (iv) etil isobutyrate, m/z 73 e 116 de 6,1 6,6 min RT, (v) o acetato de isobutil, m/z 61 e 101, de 6,6 7,6 min RT, (vi) acetato de butilo, m/z 61 e 116 de 7,7 para 9,2 min RT, (vii) isobutil isobutyrate, m/z 89 e 129, de 10,1 a 12.5 min RT, (viii) acetato de benzilo, m/z 108 e 150 de 13,1 13,8 min RT e (ix) 2-phenethyl acetato, m/z 104 e 121 de 13,8 15,5 min RT. Isoamyl álcool e isoamyl acetato foi usado como padrão interno analitos. Os ésteres foram identificados pela TR e quantificados pelas áreas de pico e curvas padrão. As curvas padrão foram determinadas utilizando ésteres puros diluídos em hexadecano em concentrações de 0,01 g / L, 0,05 g / L, 0,1 g/ L, 0,5 g / L e 1 g/L.