amerykańska Ustawa o żywności, lekach i kosmetykach z 1938 r.wymagała od producentów i firm farmaceutycznych odpowiedzialności za bezpieczeństwo dodatków do leków / substancji pomocniczych w swoich produktach w odpowiedzi na tragedię, w której 100 dzieci zostało zabitych z powodu obecności glikolu dietylenowego w produkcie przeciwbakteryjnym. Aby wyjaśnić, co jest potrzebne do stworzenia nowej substancji pomocniczej, FDA opublikowała w 2005 r.dokument zawierający wytyczne zatytułowany „Badania niekliniczne w celu oceny bezpieczeństwa substancji pomocniczych farmaceutycznych”, przedstawiający badania bezpieczeństwa niezbędne do zatwierdzenia substancji pomocniczej1, 2. Ostatnie artykuły wzywają do potrzeby bardziej alternatywnych substancji pomocniczych do stosowania we wzorach 1, 3, 4. Formulatorzy na ogół preferują precedensowe substancje pomocnicze ze względu na ich dobrze ustalony profil bezpieczeństwa, a także ryzyko i koszty związane z zatwierdzeniem nowej substancji pomocniczej3. W przypadku zakwalifikowania nowej substancji pomocniczej należy przeprowadzić badania bezpieczeństwa, a w przypadku wystąpienia zdarzenia niepożądanego istnieje wątpliwość, czy zdarzenie niepożądane było spowodowane substancją pomocniczą, czy produktem. Podczas stosowania zaróbki, o ile wcześniejsze doświadczenia z jakąkolwiek drogą podania iniekcji są cenne w uzasadnieniu jej stosowania, warto zauważyć,że zgodnie z obowiązującymi przepisami zmiana drogi podania lub zwiększenie stężenia powyżej obecnej najwyższej dawki może wymagać dodatkowych danych dotyczących bezpieczeństwa1, 2. Zapotrzebowanie na nowe substancje pomocnicze jest dobrze znane, ale poszerzenie naszej wiedzy w zakresie stosowania mniej powszechnie stosowanych substancji pomocniczych jest równie ważne, oferując jednocześnie łatwiejszą ścieżkę regulacyjną.
określenie prawidłowego pH i układu buforowego jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem w formułowaniu białka w celu zapewnienia jego rozpuszczalności i stabilności (chemicznej i fizycznej)3,5-7. Artykuł skupi się na stabilizacji bioterapeutyków. Bufory znajdujące się zarówno w małych cząsteczkach, jak i w preparatach pozajelitowych białek zatwierdzonych przez FDA zostaną użyte jako uzasadnienie do zbadania stabilizującego wpływu tych buforów na białka. W tabeli 1 wymieniono liczbę unikalnych preparatów znalezionych na etykietach produktów zatwierdzonych przez FDA. Wykluczono identyczne preparaty wynikające z formułowania produktów generycznych lub różne dawki. Ilekroć nawiązuje się do postaci soli buforu, należy założyć, że bufor jest miareczkowany wodorotlenkiem sodu lub kwasem solnym, ponieważ są to najczęściej stosowane titranty.
najczęstszymi buforami stosowanymi w preparatach pozajelitowych były cytrynian, fosforan i octan. Niektóre z mocnych i słabych stron związanych z tymi substancjami pomocniczymi zostaną podkreślone. Celem niniejszego artykułu jest zwrócenie uwagi na inne zatwierdzone, ale rzadziej stosowane środki buforujące, które wymagają szerszego zastosowania, aby stały się ogólnie akceptowane. Podczas gdy ten artykuł będzie koncentrował się wyłącznie na buforach, ten sam argument rozciąga się na inne rodzaje zaróbek. W miarę jak biotechnologia ewoluuje jako przemysł i rozwija się coraz więcej unikalnych rusztowań białkowych, coraz ważniejsze staje się znalezienie nowych sposobów stabilizacji tych białek. Czasami najczęstsze substancje pomocnicze nie są wystarczające do zapewnienia odpowiedniej stabilności lub umożliwienia technologii dostarczania leków.
eksperci branżowi z AbbVie, Vectura i Bayer dyskutują o najlepszych praktykach i doświadczeniach związanych z transformacją cyfrową w naszym najnowszym okrągłym stole
obejrzyj naszą godzinną sesję zatytułowaną „Odkryj potencjał Twojego laboratorium-odkryj, jak transformacja cyfrowa może być czymś więcej niż tylko spostrzeżeniami”, gdzie nasz panel bada, w jaki sposób transformacja cyfrowa może pomóc przyspieszyć podejmowanie decyzji, zoptymalizować procesy i usunąć nieefektywność operacyjną. Dowiesz się, w jaki sposób wdrożenie rozwiązania do zarządzania danymi pomogło organizacjom wdrożyć nowe metodologie i przekształcić procesy przepływu pracy
Obejrzyj teraz
powszechnie stosowane bufory
fosforan sodu
fosforan sodu (pKa 2,1, 7,2 i 12,3) jest najczęściej stosowanym buforem występującym w preparatach do podawania pozajelitowego(Tabela 1). Najbardziej zauważalnym ograniczeniem stosowania fosforanu jako buforu jest wpływ zamrażania na zmiany pH. zmiana pH podczas zamrażania była szeroko badana. Przesunięcie pH przypisuje się selektywnej krystalizacji soli dibasowej. Na krystalizację może wpływać szybkość zamrażania, wyjściowe pH i obecność innych korozolitów. Zmiana pH około dwóch jednostek jest dość typowa podczas zamrażania, ale odnotowano zmiany pH do 3,6 jednostek 8-10. Zmieniające się środowisko pH może destabilizować białko podczas przetwarzania substancji leczniczej luzem lub liofilizacji roztworów produktów lekowych11-17. Dotyczy to przede wszystkim warunków, w których stosuje się wysokie stężenia fosforanów lub obecne są inne substancje krystalizujące, ponieważ warunki te pomagają w indukcji krystalizacji fosforanów. Roztwory zawierające wysokie stężenia białka lub nierozpuszczalnych substancji rozpuszczalnych (np. sacharozy) hamują krystalizację fosforanów i minimalizują zmiany pH.
kwas cytrynowy
kwas cytrynowy jest jednym z najczęściej stosowanych buforów (Tabela 1). Jest to bufor trójwartościowy zawierający trzy kwasy karboksylowe o pKa 3.1, 4.8 i 6.4 (Tabela 2), oferujący szeroki zakres buforowania5. Według nieaktywnej bazy danych składników FDA, cytrynian znajduje się w ponad 100 zatwierdzonych, wstrzykiwanych produktach, co daje mu dużą historię stosowania i dowodzi jego bezpieczeństwa.
jednak badania porównujące podskórne zastrzyki preparatów buforowanych cytrynianem z preparatami buforowanymi fosforanem lub histydyną wykazały, że roztwory buforowane cytrynianem powodowały większy ból po wstrzyknięciu podskórnym 18-20. Chociaż ból ten był stosunkowo krótki (mniej niż dwie minuty), budzi obawy dotyczące przestrzegania przez pacjenta samodzielnego podawania zastrzyków zawierających cytrat18. Podczas formułowania z kwasem cytrynowym należy zwrócić uwagę na docelowy profil produktu i planowaną drogę podania. W przypadku częstych wstrzyknięć podskórnych bardziej odpowiedni może być inny środek buforujący.
kwas octowy
kwas octowy ma pKa około 4,8, oferując zakres buforowania 3,7 – 5,6 (Tabela 2). Zastosowanie kwasu octowego jest idealne do formułowania białek stabilnych w stanie ciekłym w warunkach kwaśnych. Liofilizacji roztworów kwasu octowego towarzyszy wzrost pH spowodowany sublimacją lotnej postaci kwasu buforu, pozostawiając zasadową sól. Jest to potencjalnie destabilizujące dla białka i utrudnia kontrolę pH w liofilizowanych produktach leczniczych.
dodatkowe zatwierdzone bufory
trometamina
trometamina (Tris) (pKa 8.1) ma podobne właściwości do fosforanu (pKa 7.2) i może być stosowany jako substytut w pobliżu neutralnych warunków pH. Oba bufory wykazują zmianę pH podczas zamrażania. W identycznych warunkach przesunięcie pH dla trometaminy (+2,1) było w przybliżeniu równe przesunięciu pH fosforanu ( 1,8), ale w przeciwnym kierunku (Tabela 2)8.
wybór jednego bufora nad drugim byłby prawdopodobnie zależny od wrażliwości pojedynczego białka na kierunek zmiany pH i wszelkich specyficznych interakcji białko-bufor. Wykazano, że trometamina i histydyna są lepszymi stabilizatorami niż fosforan, gdy Erytropoetyna była poddawana działaniu stresu wysokotemperaturowego, zapobiegając agregacji poprzez wspomaganie odwracalności rozkładów21. Wykazano, że Ure2p jest bardziej stabilny wobec tworzenia fibrilu, gdy jest formułowany w trometaminie w porównaniu z fosforanem22.
histydyna
histydyna, niezbędny aminokwas, staje się coraz bardziej powszechny w preparatach terapeutycznych białek. Mając pKa 6,1, jest idealny do preparatów białkowych w Warunkach neutralnych (Tabela 2).
wykazano, że histydyna chroni przeciwciało monoklonalne zarówno w stanie ciekłym, jak i liofilizowanym przed stresem cieplnym23-25. Badania oceniające stabilność interferonu-tau wykazały, że preparaty zawierające histydynę (a następnie tris, a następnie fosforan) były najbardziej stabilne w stosunku do agregacji indukowanej przez ciepło. Stabilizację tę przypisywano bezpośredniemu związaniu histydyny z białką26. Podczas liofilizacji wykazano, że histydyna i kwas asparaginowy chronią przeciwciała, działając jako donor wiązania wodorowego w celu zachowania wewnątrzcząsteczkowych β-arkuszy24-25. Ponadto stwierdzono, że histydyna ma właściwości przeciwutleniające ze względu na zdolność wiązania jonów żelaza i tlenu singletowego 24,27. Wadą stosowania histydyny jest to, że zaobserwowano, że roztwory histydyny zmieniają barwę w przyspieszonych temperaturach i kwaśnym pH, a także ekstrahują żelazo ze stali nierdzewnych24.
kwas glukonowy, mlekowy i winowy
glukonowy, kwas mlekowy i kwas winowy są substancjami pomocniczymi, które prawie wyłącznie były stosowane w preparatach małocząsteczkowych. Glukonian wapnia został dopuszczony do stosowania miejscowego w leczeniu oparzeń fluorowodorem. W cięższych przypadkach w celu zapobiegania uszkodzeniom tkanek28 stosowano infuzję 4% roztworu glukonianu wapnia w roztworze soli fizjologicznej28. Spośród 23 dostępnych na rynku preparatów do wstrzykiwania zawierających kwas mlekowy znalezionych w bazie danych FDA nieaktywnych składników, cztery preparaty są używane do leków biologicznych-dwa peptydy i dwa białka. Z 12 preparatów zawierających kwas winowy tylko jeden został użyty do formułowania białka. Bufory te mogą być odpowiednimi substytutami octanu i cytrynianu.
kwas glukonowy jest związkiem naturalnie powstałym z utleniania glukozy. Jest to interesujący związek, ponieważ ma potencjał do działania jako bufor, stabilizator i czynnik chelatujący, ponieważ ma strukturę zawierającą kwasy karboksylowe i grupy hydroksylowe.
wykazano, że winian poprawia retencję monomeru nad cytrynianem w preparacie przeciwciała o pH 4,0 – 4,5, gdy jest przechowywany w postaci cieczy w temperaturze 25°C29. Postawiono hipotezę, że grupy hydroksylowe w winianie, cytrynianie, jabłczanie, a następnie mleczanie i glukonianie mogą dostarczać stabilizujące wiązania wodorowe w fazie amorficznej liofilizowanego kake30-31.
kwas asparaginowy i glutaminowy
zarówno kwas asparaginowy, jak i kwas glutaminowy znajdują się w wlewach podawanych niemowlętom i pacjentom pediatrycznym z niewystarczającym stężeniem aminokwasów w osoczu. W Trofamine ® asparaginian i glutaminian są podawane we wlewie odpowiednio w stężeniach 22 mM i 34 mm32. Stężenia te są wystarczająco wysokie, aby zapewnić odpowiednie buforowanie preparatów białkowych.
wykazano, że kwas glutaminowy formułowany w równych ilościach z argininą poprawia stabilność i rozpuszczalność wewnątrzkomórkowych protein23,33, a także zapobiega agregacji podczas rekonstytucji23, 34-35. Badania dotyczące insuliny i albumin surowicy ludzkiej wskazują, że dodanie glutaminianu i asparaginianu mogło hamować tworzenie agregatów36-38. Badania z pegfilgrastymem wykazały, że stabilność pegfilgrastymu w postaci glutaminianu lub mrówczanu była porównywalna z octanem 39.
półprodukty cyklu kwasu cytrynowego
cytrynian, fumaran, α-ketoglutaran, jabłczan i bursztynian są wszystkie półprodukty w cyklu kwasu cytrynowego uznane za bezpieczne i skuteczne jako bufory lub jony przeciwne w preparatach do wstrzykiwania. W ograniczonej liczbie produktów stosowano fumaran, α-ketoglutaran, jabłczan i bursztynian(Tabela 1). Wynika z tego, że inne półprodukty cyklu Krebsa mogą być również odpowiednie do stosowania w pozajelitach. Związki te obejmują akonitat, izocyt i szczawiooctan. Będąc dwuwartościowymi i trójwartościowymi kwasami karboksylowymi, mają pKa w zakresie od 2,0 do 6,4, dzięki czemu związki te nadają się do szerokiej gamy preparatów (Tabela 2).
ze względu na ograniczone stosowanie tych związków jako buforów, nie jest jasne, czy ten sam ból po wstrzyknięciu związany z podskórnymi wstrzyknięciami cytrynianu byłby związany z tymi związkami. Istnieją jednak inne zalety związane z ich stosowaniem. Wykazano, że cytrynian indukuje żelowanie roztworów przeciwciał, gdy stężenie białka było większe niż 100 mg / mL. Przypisywano to trójwartościowemu charakterowi bufora. Bursztynian, posiadający tylko dwa kwasy karboksylowe, nie wykazywał takiego samego działania przy tym samym pH40.
wniosek
określenie prawidłowego pH i systemu buforowego ma kluczowe znaczenie dla wprowadzenia bioterapeutyków do kliniki i na rynek. Zapotrzebowanie na nowe substancje pomocnicze, jak również lepsze zrozumienie istniejących substancji pomocniczych jest wysoce pożądane. Histydyna, trometamina i wiele innych alternatywnych buforów oferują przewagę nad konwencjonalnie stosowanymi zaróbkami. Zastosowanie tych alternatywnych buforów może nic nie zrobić, ale pomóc w zwiększeniu narzędzi, które mają formulatorzy i może umożliwić rozwój terapeutycznego, który w przeciwnym razie mógł się nie powieść. Aby ustabilizować ogromną liczbę terapii białkowych w rozwoju, wszystkie podejścia powinny być otwarte do rozważenia.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011). Int. J. Toksykologia. 30, 600-610
2. FDA (2005) Guidance for Industry: non-clinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical zaróbki
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990). Metody w enzymologii. 182, 24-38
6. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. (2008) Pomiar i zwiększenie rozpuszczalności białka. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010) agregacja białek-szlaki i czynniki wpływające. Int. J. Farmacja. 390, 89–99
8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) Minimalizing the Aggregation of Neutral Insulin Solutions. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008). Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) Predicting the Crystallization Propensity of Carboxylic Acid Buffers in Frozen Systems-Relevance to Freeze-Drying. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) Thermophysical Properties of Carboxylic and Amino Acid Buffers at Subzero temperature: Znaczenie dla zamrożonej stabilizacji Państwa. J. Phys. Chem. B. 115, 7154-7164
o autorze
David sek uzyskał licencjat z chemii na Bates College oraz magisterium z chemii i biologii chemicznej na Northeastern University. Ma 10-letnie doświadczenie jako naukowiec formulacji, a ostatnie osiem lat spędził w firmie Pfizer badając stabilność nowych bioterapeutyków.