Dynabeadsに結合した抗体
ウサギIgG(Sigma)を、タンパク質Aを含むTAPタグが標的となっているTapタグ株に対して使用した。 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０ ７−７ ２ ９抗体を、ＣＴＣＦを標的とするＫ５ ６ ２試料に対して使用した。
Tn5精製
pET-45b(+)ベクター中のTn5E54K E110K P242A L372P14のカスタム構築物を、N末端His6タグで過活性Tn5を発現するように注文した(GenScript)。 このプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１ １ ２ １ １ ２）で入手可能である。 ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｎｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換し、単一コロニーを、５ ０ ０ｍｌのＬＢ＋５ ０μ ｇ／ｍｌアンピシリン＋３ ０μ ｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で、３ ７℃でＯＤ６ ０ ０ ０． 細胞を遠心分離によって収集し、ST緩衝液で一度洗浄し、細胞ペレットを液体窒素中でフラッシュ凍結した。
Tn5は、前述のように精製した10、改変はほとんどなかった。 ５、１ ０ ０Ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ ０％グリセロール、０.１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０）中に再懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ；１ｍｇ／１ｇの細胞ペレット）と室温で３ ０分間インキュベーションすることにより溶解した。 溶解物を4℃で20,000×gで20分間遠心分離し、上清を0.25％polyethyleneimine(Sigma)で沈殿させ、10,000×gで15分間遠心分離した。 次いで、上清を４ ７％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた（０．28g/ml）を30分間インキュベーションし、次いで20,000×gで15分間遠心分離した。＜8587＞＜7001＞ペレットを50mlのニッケル親和性負荷緩衝液（50mMリン酸カリウム、pH7.4、50mM KCl、20％グリセロール）に再懸濁し、HisTrap HPカラム（GE Healthcare;5ml）に1.5ml/分で負荷し、同じ緩衝液で平衡化した。 カラムを洗浄緩衝液I(50mMリン酸カリウム、pH7.4、1M KCl、50mMイミダゾール、20%グリセロール)、洗浄緩衝液II(50mMリン酸カリウム、pH7.4、1M KCl、50mMイミダゾール、20%グリセロール)で順次洗浄した。４、５ ０ ０ｍ Ｍ Ｋｃｌ、５ ０ ０ｍ Ｍイミダゾール、２ ０％グリセロール）で２ｍｌ／分で溶出し、次いで、Ｔｎ５を、ニッケル親和性溶出緩衝液（５ ０ｍ Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７． 溶出液を希釈緩衝液(50mMリン酸カリウム、pH7.4、20%グリセロール)で300mM KClに希釈し、TEGX300緩衝液(20mM Tris-HCl、pH7.5、300mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.1%Triton-X100)で50mlに調整した。
次に、サンプルをTEGX300と1ml/分で平衡化したHiTrapヘパリンHPカラム(GE Healthcare;1ml)に負荷した。 ５カラム容量の緩衝液で洗浄した後、１ ０ｍｌの直鎖状（３ ０ ０ｍ Ｍ〜１． Ｔｎ５は約６ ０ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌでカラムから溶出した。 ＜８ ５ ８ ７＞＜５ ９ ６ ７＞酵母クロマチン調製物＜４ ３ ９ ３＞＜７ ０ ０ １＞ＴＡＰ−ｔａｇｇｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、５ ０ ０ｍｌの酵母ペプトンデキストロース培地中で２ ５℃でＯＤ６ ０ ０＝０． 細胞は、室温で1％の最終濃度でホルムアルデヒドと15分間架橋し、125mMグリシンの最終濃度で5分間クエンチした。 細胞を遠心分離によって収集し、1mlのST緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5、100mM NaCl)中で4℃で洗浄し、2つのアリコートに分割した。 細胞を再びペレット化し、上清を除去し、ペレットを急速冷凍した。＜8587＞＜7001＞250mlの培養物アリコートを、750μ lのFA溶解緩衝液(50mM Hepes-KOH、pH7.5、150mM NaCl、2mM EDTA、1%Triton、0.5)中で溶解した。1％デオキシコール酸ナトリウム、およびCPI）および1mlの体積の0.5mmジルコニア/シリカビーズは、ミニBeadbeater-96マシン（Biospec）で3分間オン/5分間オフサイクルの三サイク 溶解物を新しい管に移し、クロマチンをペレット化するために4℃で3分間最大速度でマイクロ遠心した。 上清を捨て、ペレットを0.1%SDSを補充した750μ LのFA溶解緩衝液に再懸濁し、15mlのポリスチレン円錐管に移した。 次いで、試料をＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）中で３ ０秒のオン／オフ間隔で１ ５サイクル超音波処理して、１ ０ ０〜５ ０ ０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を得た。 ワンチップエクソアッセイは、50mlの細胞培養物（-6×108細胞）の同等物を処理しました。 これは、必要最小限の量ではなく、便利な量を表します。
K562クロマチン製剤
ヒト慢性骨髄性白血病細胞（K562、ATCC）は、10％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地中で1×105と1×106細胞/mlの間に維持され、37℃で5％CO2。 細胞をPBS(8mM Na2Hpo4、2mM KH2PO4、150mM NaCl、および2.7mM KCl)で洗浄した後、ホルムアルデヒドを最終濃度1%で室温で10分間架橋し、最終濃度125mMグリシンで5分間 上清を除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁して洗浄した。 細胞を１億個の細胞を含むように分取し、遠心分離し、上清を除去し、ペレットを急速冷凍した。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞１億個のアリコート（複数のチップで使用するため）を５ ０ ０μ ｌ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．５％ＮＰ４ ０、および完全プロテアーゼ阻害剤（ＣＰＩ、Ｒｏｃｈｅ））を氷上で１ ０分間インキュベートすることにより。 上清を除去し、ペレットを1ml(50mM Tris-pH8.0、10mM EDTA、0.32%SDS、およびCPI)に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートして核を溶解した。 試料を、６ ０ ０μ ｌの免疫沈降希釈緩衝液（ＩＰ希釈緩衝液：２ ０ｍ ＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０、２ｍ ＭのＥＤＴＡ、１ ５ ０ｍ ＭのＮａｃｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０、およびＣＰＩ）で希釈し、最終濃度（４ ０ｍ Ｍのｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０、７ｍ ＭのＥＤＴＡ、５ ６ｍ ＭのＮａｃｌ、０.４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０、０）１ ０ ０〜５ ０ ０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を得るために、３ ０秒のオン／オフ間隔で１ ０サイクルにわたってＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）で超音波処理した。
マウス組織調製
16週齢の成人男性マウス脳、肺、肝臓、腎臓の組織は、Yanming Wang博士によって寛大に提供されましたマウス組織は100mgで処理され、以前に記載されているようにクロマチンが生成されました21マイナーな修正を加えました。 手短に言えば、100mgのマウス組織を氷上で小片に粉砕し、1％ホルムアルデヒドで10分間固定し、その後、125mMグリシンの最終濃度で5分間クエンチした。 細胞を紡糸し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１ｍＬの冷たいＦａｒｎｈａｍ細胞溶解緩衝液（２ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８． 分離された核をスピンダウンすることによって単離し、RIPA核溶解緩衝液(1×PBS、1%NP-40、0.5%NaDeoxycholate、0.5%SDS、およびCPI)中に再懸濁した。 次いで、核を、１ ０ ０〜５ ０ ０ｂｐサイズ範囲のＤＮＡを生成するために、３ ０秒のオン／オフ間隔で１ ０サイクルにわたってＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）で超音波処理した。 肝細胞数は、以前に記載されたように推定された22、1mgの組織湿潤重量の換算係数を使用して、〜250,000細胞に等しい。
クロマチン免疫沈降
50mlの培養液当量の酵母または10万細胞当量のK562クロマチンをIP希釈緩衝液で200μ lに希釈し、適切な抗体で4℃で一晩インキュベー 酵母試料に、１ ０μ ｌの床容積のＩｇｇ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓを添加した。; そして、３μ ｇの抗ＣＴＣＦ抗体を、１ ０μ ｌのスラリー当量のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に、Ｋ５ ６ ２試料に添加した。
ChIP-exo1.1
ChIP-exo1.1は前述のように実行されました7,8,23. 手短に言えば、以下の酵素工程を、各工程の間に複数の塩洗浄を伴う樹脂上の免疫沈降クロマチンを用いて実施した。: T4DNAポリメラーゼ末端研磨、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、KlenowフラグメントA-テーリング、T4DNAリガーゼ媒介Read_2アダプターライゲーション、phi29DNAポリメラーゼ充填、第二T4ポリヌクレオチドキナーゼ、ラムダexonuclease消化、およびRecJfエキソヌクレアーゼ消化。 一晩の逆架橋およびプロテイナーゼK処理に続いて、以下のステップは、溶液中で実施した：phi29プライマー拡張、第二KlenowフラグメントA-テーリング、T4DNAリガーゼ媒介Read_1
チップ-exo3.0と3。1(タグ化ベース版)
免疫沈降後、樹脂上で以下の工程を行った。 トランスポザーゼを組み立てるために、Tn5を以下の成分を含む10×トランスポザーゼミックス中でインキュベートし、室温で30分間インキュベートした：12.5μ M Tn5、50%グリセロール、および7.5μ Mアダプター(Nexa2/ME comp)。 この研究で使用されるオリゴヌクレオチド配列については、補足表1を参照してください。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞樹脂上のチップ材料を、ｆａ溶解緩衝液、Ｎａｃｌ緩衝液（５ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯ Ｈ、ｐＨ７．１％デオキシコール酸ナトリウム）、Ｌｉｃｌ緩衝液（１ ０ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０、５ ０ ０ｍ Ｍ Ｌｉｃｌ、１％ＮＰ−４ ０、１％デオキシコール酸ナトリウム）、及び１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８.０（４℃で）＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞を含有するタグ化反応（３ ０μ ｌ）：２ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７.５、５ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、１ ０％ジメチルホルムアミド、及び１×タグ化混合物（１×タグ化混合物）を含む。５、５ ０ ０Ｍ Ｍグアニジン−塩酸塩、２Ｍ Ｍ Ｅｄｔａ、１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０、０で樹脂を２回洗浄した。ｐｔａは、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、１ ０ ０ｍ Ｍ、＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞１ ０Ｕのｐｈｉ２ ９ポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１×ｐｈｉ２ ９反応緩衝液（ＮＥＢ）、２×（２ ０ ０μ ｇ／ｍｌ）ＢＳ Ａ、および１ ６ ５μ ＭのｄＮＴＰを含む充填反応（３ ０μ ｌ）を３ ０℃で２ ０分間インキュベートした。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞10U T4pNK(NEB)、1×t4Dnaリガーゼ緩衝液(Neb)、および2×bsaを含むキナーゼ反応(30μ l)を37℃で15分間インキュベートした後、10mM Tris-hcl、ph8.0で4℃で洗浄した。: １％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０、および５％ＤＭＳＯを３ ７℃で３ ０分間インキュベートし、次いで、１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞樹脂からＤＮＡを溶出させ、逆架橋およびプロテイナーゼＫ処理（４ ０Μ ｌ）：３ ０μ ｇプロテイナーゼＫ、２ ５ｍ ｍトリス−Ｈｃｌ、Ｐｈ７を含有して行った。＜８ ５ ８ ７＞、＜７ ０ ０ １＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、＜８ ５ ８ ７＞、５％ＳＤＳを６ ５℃で１ ６時間インキュベートした後、上清を新しい管に移し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で製造業者の指示に従って精製し、ＤＮＡ体積（７ ２μ ｌ）に添加した１．試料を１ ０μ ｌの水中でアンプルビーズから溶出し、以下の酵素工程を溶液中で実施した。
アダプターライゲーション(バージョン3.0):プライマー伸長反応用(総反応量20μ l); 再懸濁された試料に、1×phi29反応緩衝液、2×BSA、100μ M dNTP、および0.5μ M ME配列オリゴヌクレオチド（合計9μ L）を加え、95℃で5分間インキュベートし、次いで45℃で10分間インキュベートして、オリゴ時間をアニールさせた。 試料を３ ０℃にシフトさせた後、１ ０Ｕ ｐｈｉ２ ９ポリメラーゼ（１μ ｌ）を添加し、３ ０℃で２ ０分間インキュベートした後、６ ５℃で１ ０分間不活性化させ、３ ７℃にシフトさせた。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞; プライマー伸長反応物に、１ ０Ｕ Ｋｌｅｎｏｗ断片、−ｅｘｏ（ＮＥＢ）、１×Ｎｅｂｕｆｆｅｒ２、１ ０ ０μ Ｍ ＤＡＴＰ（合計１ ０μ ｌ）を加え、３ ７℃で３ ０分間インキュベートし、次いで７ ５℃で２ ０分間不活性化し、２ ５℃にシフトして、第２のａｄａｐｔｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ反応（総反応体積４ ０μ ｌ）に、ａ−ｔａｉｌｉｎｇ反応物に、２，０ ０ ０Ｕ Ｔ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１×Ｎｅｂｎｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（合計１ ０μ ｌ）を加えた。緩衝液（ｎｅｂ）、３ ７ ５Ｎｍアダプター（Ｅｘａ１−５ ８／１ ３）および２ ５℃で１時間インキュベートした。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞副木結紮（バージョン３．; 再懸濁されたＤＮＡに、１，２ ０ ０Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３ ７ ５ｎＭアダプター（Ｅｘａ１−５ ８／Ｅｘａ１−ＳＳＬ＿Ｎ５）を加え、２ ５℃で１時間インキュベートした。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞バージョン３． 次いで、試料をＰＣＲを介して増幅した。 ＰＣＲ増幅のために（全反応体積４ ０μ ｌ）；再懸濁されたＤＮＡに、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｏ Ｔ Ｓｔａｒｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｆ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ ０ ０μ ＭのｄＮＴＰ、５ ０ ０ｎＭの各プライマー（Ｐ１．3およびNexa2-iNN）および18サイクル（98℃の変性で20秒、52℃のアニーリングで1分、および72℃の伸長で1分）増幅された。 反応の四分の一は、追加の六つのサイクル（24合計）のために増幅され、ライブラリの存在は、2％アガロースゲル上の電気泳動によって決定されました。＜8587＞＜7001＞サイズ選択：200-500bp PCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて2％アガロースゲルからゲル精製した。＜8587＞＜5967＞ChIP-exo4.0および4.1（single-strand DNA ligation versions）＜4393＞＜7001＞免疫沈降後、樹脂上で以下の工程を行った。 ５Ｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉ（ＮＥＢ）、２ ５Ｕ Ｔ４ＰＮＫ、１×Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、および３ ９ ０μ Ｍ ｄＮＴＰを含有する末端修復反応（５ ０μ ｌ）を１ ２℃で３ ０分間インキュベートし、次いで、１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０、および５％ｄｍｓｏを含有するΜエキソヌクレアーゼ消化（１ ０ ０μ ｌ）を３ ７℃で３ ０分間インキュベートし、次いで、１ ０Ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８で洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１ ０ ０、および５％ＤＭＳＯ ｓｗａを含有するＲｅｃｊｆエキソヌクレアーゼ消化（１ ０ ０μ ｌ）を３ ７℃で３ ０分間インキュベートし、次いで１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．Ａｄａｐｔｅｒｉｏｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ１ ２ ０ ０Ｕ ｔ４ｄｎａ ｌｉｇａｓｅ、１×Ｔ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、および３ ７ ５ｎｍのｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ Ａｄａｐｔｅｒ（ＥＸＡ１−５ ８−Ｎ５）を２ ５℃で１時間インキュベートした後、１ ０ｍ ｍ Ｔｒｉｓ−ｈｃｌ、ｐＨ８．: 1200U T4DNA Ligase、1×T4DNA Ligase Buffer、および375nM adapter(Exa2.1-N5/Exa2.1-20)を1時間25℃でインキュベートした後、10mM Tris-HCl、pH8.0で4℃で洗浄した。
バージョン4.0と4.1の両方：樹脂からDNAを溶出し、逆架橋およびプロテイナーゼK処理（40μ l）を行った。５、２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、２ ０ ０Ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、および０．その後、上清を新しい管に移し、製造業者の指示（1.8×体積）に従ってAgencourt AMPure magnetic beads（Beckman Coulter）で精製した。 試料を２ ０μ ｌの水中でアンプルビーズから溶出し、以下の酵素工程を溶液中で実施した。＜8587＞＜7001＞第二アダプター連結：ssDNA連結（バージョン4.0、全反応量40μ l）：再懸濁されたDNAに1200UのT4DNAリガーゼ、1×T4DNAリガーゼ緩衝液、375nMアダプター（Exa2.1-N5/Exa2.1-20）を加え、25℃で1時間インキュベートした。＜8587＞＜7001＞Splint adapter ligation（バージョン4.1、総反応量40μ l）：再懸濁されたDNAに1200U T4DNA ligase、1×T4DNA Ligase Buffer、375nM adapter（Exa1-58/Exa1-SSL_N5）を加え、1時間25℃でインキュベートした。＜8587＞＜7001＞バージョン4.0および4.1の両方：ライゲーション反応をアンプルビーズ（1.8×体積）を15μ lの水に再懸濁した。 次いで、試料をＰＣＲを介して増幅した。 PCR増幅用(総反応量40μ l); 再懸濁されたＤＮＡに、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｏ ｔ Ｓｔａｒｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｆ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ ０ ０μ ＭのｄＮＴＰ、５ ０ ０ｎＭの各プライマー（Ｐ１.３およびＮｅｘａ２−ＩＮＮ）を加え、１ ８サイクル（９ ８℃変性で２ ０秒、５ ２℃アニー 反応の四分の一は、追加の六つのサイクル（24合計）のために増幅され、ライブラリの存在は、2％アガロースゲル上の電気泳動によって決定されました。 サイズ選択：２ ０ ０〜５ ０ ０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２％ａｇａｒｏｓｅゲルからゲル精製した。
注:ChIP-exo4.0/4.1にはユニバーサルRead_2アダプタが組み込まれており、バーコードは長いプライマーを使用したPCR中に後で追加されました。 長いPCRプライマーは、ラムダエキソヌクレアーゼ消化を含むライブラリの構築に使用されたときはいつでも、ライブラリは、低収率と高いアダプタダイマー 現在は、全長アダプターと最小長PCRプライマーのみを使用しています。
ChIP-exo5.0
免疫沈降後、樹脂に対して以下の工程を行った。 樹脂上のチップ材料を、ＦＡ溶解緩衝液、Ｎａｃｌ緩衝液、Ｌｉｃｌ緩衝液、および１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．１ ２ ０ ０Ｕ Ｔ４Ｄｎａリガーゼ、１ ０Ｕ Ｔ４ｐｎｋ、１×Ｎｅｂｎｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、および３ ７ ５Ｎｍアダプター（Ｅｘａ２＿ｉｎｎ／ｅｘａ２ｂ）を含有する４ ５μ ｌ）を２ ５℃で１時間インキュベートした後、１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８． 10U phi29ポリメラーゼ、1×phi29反応緩衝液、2×BSA、および180μ M dNTPを含む充填反応（40μ l）を30℃で20分間インキュベートし、次いで10mM Tris-HCl、pH8.0で4℃で洗浄した。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞樹脂からｄｎａを溶出させ、逆架橋およびプロテイナーゼＫ処理（４ ０μ Ｌ）を含有して行った。＜８ ５ ８ ７＞＜７ ０ ０ １＞ｄｎａを、１ ０ｍ ｍのＴｒｉｓ−ｈｃｌ、ｐｈ８．: ５、２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、２ ０ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、および０.５％ＳＤＳを、６ ５℃で１ ６時間インキュベートした。上清を新しい管に移し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、製造業者の指示書（１.８×体積）に従って精製した。試料を２ ０μ ｌの水中でアンプルビーズから溶出し、以下の酵素工程を溶液中で実施した。 第二のアダプター結紮のために（総反応量40μ l）: 再懸濁されたＤＮＡに、１ ２ ０ ０Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、３ ７ ５ｎＭアダプター（Ｅｘａ１−５ ８／Ｅｘａ１−ＳＳＬ＿Ｎ５）を加え、２ ５℃で１時間インキュベートした。＜8587＞＜7001＞その後、試料をPCRで増幅した。 ＰＣＲ増幅のために（全反応体積４ ０μ ｌ）；再懸濁されたＤＮＡに、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｏ Ｔ Ｓｔａｒｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈ Ｆ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ ０ ０μ ＭのｄＮＴＰ、５ ０ ０ｎＭの各プライマー（Ｐ１．1)および18の周期のために増幅されて（98°Cの変性の20s、52°cのアニーリングの1分、72°C延長の1分）。 反応の四分の一は、追加の六つのサイクル（24合計）のために増幅され、ライブラリの存在は、2％アガロースゲル上の電気泳動によって決定されました。 サイズ選択：２ ０ ０〜５ ０ ０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２％ａｇａｒｏｓｅゲルからゲル精製した。
注:この段階でゲル精製以外の方法を使用すると、最終サンプル中に許容できないほど高いレベルのアダプター二量体が生じることがわかりました。 ゲルの浄化は効果的にアダプターの二量体（150bpの片）および破片exoの図書館（200bpの片=150bpのアダプター+50bpの挿入物）のより小さい片を分けることができます。
DNAシークエンシング
ハイスループットDNAシークエンシングは、ペアエンドモードでNextSeq500で実行され、2×40bp読み取りが生成されました。 その後、配列読み取りを、bwa-mem(v0.7.9a)を使用して酵母(saccer3)およびヒト(hg19)ゲノムに整列させた24。 整列された読み取りは、非一意の整列およびPCR重複を除去するためにフィルタリングされた。 ＰＣＲ重複は、同一のＲｅａｄ＿１およびＲｅａｄ＿２配列を有する配列リードとして定義した。
データの可用性
この研究からのすべてのシーケンスファイルとピークファイルは、ncbi Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)でアクセッション番号GSE110681およびGSE114606で入手できます。 このペーパーの図を生成するために使用される座標ファイル、スクリプトパラメータ、およびカスタムコードは、https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunicationsからダウンロードできます。
その他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて著者から入手可能です。