Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)assayは、特定のタンパク質とゲノムDNA領域との相互作用の発見された知識を持つ転写調節モニタリングのための重要な方法です。 生きている細胞のDNA結合蛋白質（転写因子およびヒストンを含む）が結合しているDNAに架橋することができるという事実を考えると、ChIPは適切な抗体 免疫沈降された複合体は遠心分離によって集められ、蛋白質は西部のしみおよびLC/MSのようなそれ以上の分析のために溶離されます。 この議定書は速く、効率的な方法の巧妙な破片の試金を達成するために詳しいプロシージャを提供する。
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- 37% ホルムアルデヒド
- 1Mグリシン
- 細胞溶解緩衝液:150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.5%NP-40、1%Triton X-100、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル付き。
- PBS:pH7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. 培養液1mLあたり27μ lの37％ホルムアルデヒドを加えて1％の最終濃度を得、揺動または揺動装置でゆっくりと揺動しながら室温で10分間細胞をインキュベー
2. 培養培地1mL当たり141μ lの1Mグリシンを添加して架橋をクエンチし、最終濃度を125mMで得、細胞を室温で5分間インキュベートする。
3. 浮遊細胞の場合：コレット細胞を15mLの円錐管に入れ、2,000×gで4℃で5分間遠心します。 上清を捨て、冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。
ステップ5にスキップします。
4. 付着力の細胞のため:媒体を取除いて下さい、冷たいPBSと細胞を二度洗浄して下さい。 細胞を１ ５ｍｌの円錐管中でＰＢＳ中にこすり、４℃で２，０ ０ ０×ｇで５分間遠心する。
溶解および超音波処理
5. 上清を捨て、1×107細胞あたり1mLの冷細胞溶解緩衝液を加える。 数回の間上下にピペットで移すことによって餌を再懸濁し、10分の氷で孵化させて下さい。
6. クロマチンを0.5〜1kbの断片に剪断する超音波処理。 泡を避け、氷のサンプルを保って下さい。
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- 超音波処理条件は、サンプルとsonicatorモデルに依存して最適化する必要があります。 典型的には、出力6.0で45秒の休息期間が続く六つの15秒パルスが動作することが判明しています。 分析のために片のサイズは、せん断されたクロマチンのアリコートから総DNAの小さい容積を得、次にアガロースゲル（1~2%）で分析します。
- 超音波処理効率を維持するために、容量は≤1mLであることが示唆されています。
7. 12,000×gで4℃で10分間遠心分離し、上清を保持した。
8. 0.5mLの上清を新鮮な1に移す。DNAの片の分析のための5つのmLの管。
免疫沈降
9. サンプルに関連した抗体か正常なIgGを加え、室温の超音波湯せんの15分の間孵化させて下さい。
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- 抗体が産生されたのと同じ種からIgGを選択します。
- 抗体と抗原に依存してインキュベーション時間を最適化する必要があります。 発現レベルの低い抗原については、インキュベーションは、回転プラットフォーム上で一晩4℃で行うことができます。
10. プロテインA-アガロースビーズを準備する: ビーズを１ｍｌの溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含まない）で３回洗浄し、２ ０ ０ ０×ｇで４℃で数秒間遠心分離した後、上清を廃棄する。
11. 溶解緩衝液でビーズを1:1に希釈し、50μ lをサンプルに加えます。
12. 回転台で4°Cで30〜45分間インキュベートします。
13. ２ ０ ０ ０×ｇで４℃で１分間遠心分離した後、上清を廃棄する。
14. ビーズを1mLの溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤なし）で四回洗浄し、上清を捨てる。
DNA精製および分析
15. 洗浄したビーズを１ ０ ０μ ｌの１ ０％Ｃｈｅｌｅｘ１ ０ ０で再懸濁する。
16. 数秒間上下にピペットを入れ、サンプルを10分間沸騰させます。
17. 室温で12,000×gで1分間遠心分離し、上清を新鮮な1.5mLチューブに移した。
18. DNA精製キットまたは標準フェノール：クロロホルム抽出プロトコルを使用してDNAを精製する。
19. Dnaを50μ l ddh2oで溶解し、PCR反応に2-10μ lのDNAサンプル（反応量の25％）を使用してください
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