結果と議論
接種の日に、滅菌緩衝されていないジャガイモのデキストロース寒天（PDA）のpHは5.63であったが、滅菌緩衝PDAのpHは3.51から9.35であった。 室温（25℃）でのインキュベーションの四週間後、滅菌寒天のpHは、バッファなし、トリス緩衝およびトリス-マレイン酸緩衝PDAのために（同じくらい0.19）低下し、クエン酸-リン酸緩衝および炭酸塩-重炭酸緩衝PDA（表1）で（0.24まで）増加した。
表1.
滅菌ジャガイモのデキストロース寒天のpH測定。
| ミディアム | 緩衝液の予測pH | 実際のpHa | |
|---|---|---|---|
| 無菌寒天 | |||
| 0日目 | 日目28 | ||
| バッファなしPDA | n/a | 5.63 | 5.47 |
| トリスバッファ型PDA | 7.20 | 6.61 | 6.50 |
| 8.00 | 7.61 | 7.59 | |
| 9.00 | 8.24 | 8.19 | |
| クエン酸-リン酸緩衝液 | 3.00 | 3.51 | 3.69 |
| 4.00 | 4.28 | 4.49 | |
| 5.00 | 5.17 | 5.40 | |
| 6.00 | 6.07 | 6.31 | |
| 7.00 | 7.01 | 7.23 | |
| 炭酸塩-重炭酸塩緩衝型PDA | 9.20 | 9.07 | 9.13 |
| 10.00 | 9.25 | 9.26 | |
| 10.70 | 9.35 | 9.39 | |
| トリス-マレイン酸緩衝PDA | 5.20 | 5.21 | 5.02 |
| 6.00 | 5.84 | 5.75 | |
| 7.00 | 6.53 | 6.45 | |
| 8.00 | 7.37 | 7.30 | |
| 8.60 | 7.91 | 7.83 | |
3つのサンプルの平均が示されています。
バッファなしPDA（pH5.63）上のコロニーは、四週間後に直径60ミリメートルに達した。 PDAのpHをTrisバッファー（pH6.61、7.61および8.24）で上昇させたとき、平均コロニーサイズはバッファなしPDA（図1およびand2a）のものと比較して高かった。2A）。 ペリテシアはバッファされていないＰＤＡとすべてのＴｒｉｓバッファされたメディアに四週間までに存在していた。 子嚢胞子は、ph6.61と7.61ではなく、pH8.24でバッファされていないPDAとトリスバッファされたPDA上で四週間後に観察された。 子嚢胞子は、pH8.24でTris緩衝PDA上で接種後八週間まで観察されなかった（表2）。
Cのコロニー径の比較 緩衝されたおよびunbufferedポテトの右旋糖の寒天のglobosum。 接種当日の各培地の実際のｐＨをｘ軸に記載する。 コロニー直径は毎週測定した。 各プレートの最大直径は83mmであり、平均値と平均値の標準誤差が示されている（n=15プレート）。
トリス緩衝および未緩衝ポテトデキストロース寒天（a）、クエン酸-リン酸緩衝ポテトデキストロース寒天（b）およびトリス-マレイン酸緩衝ポテトデキストロース寒天（c）上の4週間でのc.globosumコロニーの写真。 各寒天プレートの中心に、２ ０μ ｌの水に懸濁した５ ０ ０個のｃ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ胞子を接種した。 これらの写真は、室温でのインキュベーションの四週間後にC.globosumコロニーを持つ寒天プレートの前面と裏面を示しています。
テーブル2
胞子形成に対するpHの影響。
| ミディアム | 緩衝液のpH予測 | テープスライド結果 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ペリテシアの存在 | 子嚢胞子の存在 | ||||||||
| 4週目 | 6週目 | 8週目 | 4週目 | 6週目 | 8週目 | 8週目 | 8週目 | 8週目 | 8週目 |
| バッファなしPDA | n/a | + | + | + | + | + | + | ||
| トリスバッファ型PDA | 7.2 | + | + | + | + | + | + | ||
| 8.0 | + | + | + | + | + | + | |||
| 9.0 | + | + | + | − | − | − | |||
| Citrate-phosphate buffered PDA | 3.0 | − | NT | NT | − | NT | NT | ||
| 4.0 | − | + | + | − | − | + | |||
| 5.0 | − | + | + | − | − | + | |||
| 6.0 | − | − | + | − | − | − | |||
| 7.0 | − | + | + | − | − | + | |||
| 9.2 | − | − | − | − | − | − | |||
| 10.0 | − | − | − | − | − | − | |||
| 10.7 | − | − | − | − | − | − | |||
| トリス-マレイン酸緩衝PDA | 5.2 | − | − | − | + | + | + | ||
| 6.0 | + | + | + | + | + | + | |||
| 7.0 | + | + | + | + | + | + | |||
| 8.0 | + | + | + | − | + | + | |||
| 8.6 | + | + | + | + | + | + | |||
テープスライドは、接種後四、六または八週間で単一の寒天プレートから採取した。 Peritheciaおよび子嚢胞子の有無は、それぞれ”+”または”−”で示される。 採取されていないサンプルは”NT”で示されています。
クエン酸リン酸緩衝液を使用して、3.51から7.01までのpHsの範囲のPDAを得た（表1）。 7.01のpHで培養したコロニーは、接種の4週間後にプレート全体(直径83mm)を覆った(図2B)。 各培地でｐｈが減少するにつれて，コロニーサイズは減少した。 四週間後、コロニーは3のpHで成長した。51は直径11mmの平均に達しただけで（図1）、テープスライド上に菌糸フィラメントは観察されなかった（データは示されていない）。 4.28、5.17、6.07および7.01のpHでは、接種後四週間生産されなかったが、最終的には接種後八週間を形成した。 8週間後、子嚢胞子は4.28、5.17および7.01のpHで存在した（表2）。
炭酸塩-重炭酸塩緩衝液は、PDAのpHをTris緩衝液（pH9.07、9.25および9.35）よりも高く上昇させた（表1）。 各炭酸塩-重炭酸塩緩衝培地上の平均コロニーサイズは、7.01のpHでクエン酸塩-リン酸塩緩衝PDAと比較して低かった（図1）。 接種後4、6または8週間では、ペリテシアまたは子嚢胞子は観察されなかった（表2）。＜3608＞＜8250＞トリス-マレイン酸緩衝液は、PH5.21から7.91の範囲のPDAをもたらした（表1）。 二週間後、最大のコロニーは、最低pHで観察された。三、四週間で、最大の直径を有するコロニーは、pH7.37と7.91のPDA上にあった（図1とand2c）。2C）。 四週間で、多数の子嚢胞子は5のpHで観察された。一方、他のＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝ＰＤＡでは子嚢胞子はほとんど見られなかったか、または全く見られなかった（データは示されていない）。 ６週間以内に、子嚢胞子を各培地上で産生させた（表２）。
全体として、最大のコロニーは中性pH(7.01)で得られました(図1)。 二週間で、これらのコロニーは、他のすべての培地に比べて有意に大きかった。 4週間までに、各培地の平均コロニーサイズは、pH7.01と比較してpH6.07、7.37、7.61、および7.91を除いて有意に小さかった（データは示されていない）。 各グループの胞子の総数は、前述のように決定した。 子嚢胞子の検出可能なレベルは、接種後四週間でセブンティーンのメディアのうち、次の三つで観察された：4,240,000グループあたりの胞子（すなわち、五つの寒天プレート） テープスライドは、他の四つの緩衝媒体上の子嚢胞子の生産を明らかにした（6.61と7.61のpHでトリス緩衝PDA;8.84と7のpHでトリス-マレイン酸緩衝PDA。91)(表2)、これは血球計の検出限界(10,000胞子/mL)を下回っていた。 ＣｈａｅｔｏｇｌｏｂｏｓｉｎｓａおよびＣの産生をＨＰＬＣを用いて前述したように評価した。 Chaetoglobosin CはpH7.01（寒天プレートあたり平均203μ g）で検出されましたが、他のpHでは培地からは検出されませんでした（図3）。 いずれの試料においてもチャエトグロボシンＡは検出されなかった（データは示されていない）。
選択したピークのUVスペクトルを挿入したHPLCクロマトグラム。 クロマトグラムは、cのメタノール抽出物から得られた信号を示す。 globosumは7.01のpHで四週間五つのクエン酸リン酸緩衝ジャガイモ右旋糖寒天プレート上に成長しました。 保持時間（分）はｘ軸上にプロットされ、ピークサイズ（ミリ吸光度単位）はｙ軸上にプロットされる。 UVスペクトル（インセット）の場合、波長（ナノメートル単位）がx軸にプロットされ、ピークサイズ（ミリ吸光度単位）がy軸にプロットされます。
いくつかの研究は、C.globosumの成長に周囲のpHの影響を検討しています。 C.globosumの成長のための最適なpH範囲は、以前に7.1から10.4として記載されていました。 我々の結果は、この菌が異なるpH値（約4.3-9.4）の範囲にわたって成長する可能性があることを示している。 C.globosumはpH3.51で成長しましたが、これらのコロニーはサイズが小さく、異常な形態を示していました(図2)。 C.globosumの成長は中性pHで最適です(図1)。
chaetoglobosin Cの検出可能なレベルは、最大のC.globosumコロニーを持つ培地でのみ観察された。 この知見は、chaetoglobosinsの産生が直接成長に関連していることを示唆している以前の研究からの我々の結果と一致しています。 Cの成長を調べた後。 グローボサム四つの市販の培地では、我々は最高の成長をサポートする培地はまた、chaetoglobosins AとCの最高の生産をサポートしていることがわかりました。
周囲pHは、他の糸状菌の代謝産物産生に影響を与えることが示されています。 最もよく研究されている調節システムは、PacCと呼ばれる転写因子によって制御されるAspergillus nidulansにあります。 アルカリ性条件下では，Ｐａｃｃはペニシリン合成に関与するａｃｖａやｉｐｎａなどのアルカリ性発現遺伝子を活性化し，ステリグマトシスチン合成に関与するｓｔｃｕなどの酸発現遺伝子を抑制する。 Ｐａｃｃ同族体を有する他の糸状真菌には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ orｙｚａｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓが含まれる。 PacCに類似した仮説的なタンパク質は、C.globosumゲノム内に位置しています。 この真菌がAと同様の規制システムを持っていると仮定する。 ｎｉｄｕｌａｎｓ，これらの結果は，ｃｈａｅｔｏｇｌｏｂｏｓｉｎ産生はその制御下にないことを示唆した。
C.globosumによるペリテシアおよび子嚢胞子の形成は、酸性環境で好まれ、人工培地上の塩基性条件下で阻害されるようである。 四週間後、子嚢胞子は、バッファなしPDA（pH5.63）およびトリス-マレイン酸緩衝PDA（pH5.21および6.53）上に検出可能なレベルで存在した（表2）。 C.globosumは最終的にクエン酸-リン酸緩衝PDA八週間接種後にpertheciaと子嚢胞子を生産しました。 子嚢胞子はpH8でTris緩衝PDA上で生産されませんでした。24または炭酸塩-重炭酸塩緩衝PDA上でpH9.07、9.25および9.35で（表2）。 塩基性ｐ ｈでの胞子形成のこの阻害は，緩衝液の成分の一つの存在によるものである可能性もあるが，そのメカニズムは現時点では不明である。