Discussion
ブロス培地でインキュベートした成体C.sinensisワームは、最初に4,000個以上の卵/ワーム/日を生産しました。 その後、卵数は1,000日目に7を超え、300-400日目に14に減少した。 ブロス培地では100日で28日よりもカウントが低くなった。 3つのブロス媒体の間では、カウントは互いに類似していた。 これとは対照的に、ロックの魂のカウントは、それぞれ220±44と1023±64日目の1と3であった。 これらのカウントは、最初にブロス培地のものよりも低かったが、ワームは21日目以降に多くの卵を生産した。 ブロス培地中の虫はインキュベーションの初期段階でより活発に卵を産生したが，ロック溶液中の虫は毎日卵を産生しなかったが，より長い期間卵を産生した。 一人の成虫による4,000の毎日の卵数は、感染した人間からの3,770の卵の推定平均数と互換性があった。
卵数に基づいて、8週間の感染後にウサギから回収されたインキュベートされた成虫ワームによって産生された総卵は、平均で37,274±2,988と推定された。 これらの総卵数は培養液または培地にかかわらず類似していた。 毎日の卵数は急速に減少し，子宮は栽培中に空になった。 したがって，現在の毎日の卵数は，ｉｎｖｉｔｒｏ栽培虫が栽培前にウサギに住んでいる間に子宮内に予め形成された子宮内卵のみを産生することを表していた。 データに基づいて、一つのgravid C.sinensisは、その子宮内に約37,000個の卵を含み、毎日約4,000個の卵を生産すると推定されている。 したがって、卵は子宮内成熟のために約10日間子宮内に留まることがある。 子宮内の卵のほとんどは成熟しており，すでにmiracidiumが発達していたが，そのうちのいくつかは主に近位子宮内で未成熟であった。 これらの未成熟卵は栽培中にさらに発達しなかった。 これらの結果は，栽培された虫は新しい生存卵を形成することができず，ｉｎｖｉｔｒｏ栽培では事前に形成された未成熟卵の成熟も不可能であることを示唆している。
C.sinensisの卵の大きさは28-31×13-16μ mで、円錐形の端にoperculumと小さなabopercularノブを持っています。 本研究では，放出された卵は，ワームが長く生存するにつれて異常な輪郭を示した。 卵の平均長さは、ロックの溶液（27.49±0.48μ m）およびすべてのブロス培地で徐々にかつ有意に減少した。 長さの減少はＦＭＩ値の減少をもたらした。 Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｉｄとｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｉｄ吸虫の卵の体積を近似するための生体分析のためのパラメータとしてＦＭＩを提案した。 本調査では、Fmi値は、ロックの溶液中で60日目とブロス培地中で90日目に減少した。 Ｆｍｉ値の減少は，長さの収縮と内容物の変性による卵体積の減少を示唆した。 In vitro栽培の60日後に生産された卵のほとんどは変形し、その長さ/幅比は1.7未満であり、FMI値は7,000未満であった。 これらの卵のほとんどは、トリパンブルーで染色したときに生存不可能であると判断された。 60日間の栽培は、卵の生存率の最大期間である可能性があります。
光学顕微鏡観察では、栽培が60日以上続いたため、卵殻内に液胞と暗い塊が蓄積していることが明らかになりました。 空胞と暗塊はＯ．ｖｉｖｅｒｒｉｎｉに示すようにビテリン細胞を変形させたと考えられた。 卵中のこれらの材料は，ビテリン細胞または他の卵形成材料が変性し，卵が中絶していることを示唆した。 Miracidiumを形成する成熟した卵は長く生き残ることができますが、中止された卵は生き残れません。 内部材料の変性は変形および卵容積の減少を誘発した可能性がある。 研究では、成熟したEchinostoma caproni gravid成人がロックの溶液に4℃で4ヶ月まで保存したときに変形した卵を発見した。 上記の変化のための一つの可能な説明は、卵殻形成のプロセスに関連付けられている不適切なキノン日焼けであってもよいです。 長期間のｉｎｖｉｔｒｏ栽培は，このフェノールオキシダーゼ媒介酵素プロセスに影響を与え，卵殻を変形させたと考えられた。 このようにＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓのｉｎｖｉｔｒｏ栽培の長期化は，卵とその生存率を変形させる可能性がある。
C.sinensisの成熟した卵は非常に目立たないabopercularノブを含んでいます。 近縁の肝吸虫であるo.viverriniも、卵の非常に小さいからわずかに発達したabopercularノブを示しています。 本研究では、卵殻のabopercularノブは、インキュベーションの60日後に卵のほとんどでより顕著になった。 このような顕著なabopercularノブの出現は、ほとんどの退化した卵で明らかであった。 ＫｒｅｊｃｉとＦｒｉｅｄは，それぞれｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍａｃａｐｒｏｎｉとＥ．ｔｒｉｖｏｌｖｉｓの場合には，ａｂｏｐｅｒｃｕｌａｒノブが卵殻に浅いか深く埋め込まれることを示した。 本研究では，シェルを囲むabopercularノブのInfoldingは観察されなかった。 顕著なabopercularノブは死ぬみみずの変更生理学に応じて存在していた正常で目立たないノブの延長であるかもしれません。 まとめると、吸虫がin vitro栽培によって正常な生存可能な卵を生産することは困難である。
SEMによって観察された卵の表面構造は、卵殻の状態を理解するのに適した形態学的特徴であると思われた。 Opisthorchiidsの中で、C.sinensisの卵の表面は非常に自然な水生繊維を集め、軟体動物のホストとの接触の可能性を高める機能を助けるさまざまな高さの織り交ぜられた 本研究では，中止した卵のＳＥＭにより表面しわの減少が観察された。 顕著なabopercularノブとのこの減少されたしわが寄ることは卵殻の退化プロセスの結果であるかもしれません。
本研究にはいくつかの制限があった。 形態学的変化と比較するための卵生存率の直接的なデータはなかった。 卵のｉｎｖｉｔｒｏふ化は卵の生存率に正確な情報を与えることができるが，Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ卵のそれはまだできない。 また、インキュベートされたワームの形態および生理学のデータは限られていた。
結論として、栽培されたC. ブロス培地中のsinensisワームは、ウサギの生存中に子宮内で予め形成された60日間生存可能な卵を通過させる。 予め形成された未成熟卵はｉｎｖｉｔｒｏ培養ではmiracidiumを発達させることができない。 成熟したC.sinensisの成虫は、子宮内に約37,000個の卵を含み、毎日約4,000個の卵を産生する。 FMI値が7,000未満、長さ/幅比が1.7未満の変形卵は生存不可能である。