plain sightに隠された–非常に豊富で多様な浮遊性淡水Chloroflexi

淡水環境におけるChloroflexi門の豊富さと多様性

16S rRNAに基づいて、湖、貯水池、河川からの117メタゲノムからの豊富さ、chloroflexi門の代表者は、原核生物の7％まで構成されていた。epilimnionのコミュニティ（fig. しかし、図1a、b）に示すように、大きな変動がある。 これまでの観測と同様に、CL500-11系統は低カリウムイオン試料を支配していた（一つの試料を除くすべてで少なくとも16％、琵琶湖からの一つの試料でほぼ27％に達した）。 1c)、TK10クラスターと呼ばれるあまり知られていないグループを除いて。 SILVAデータベースのtk10関連16S rRNA配列の大部分は、土壌、人間の皮膚、または未知のメタゲノムサンプルに由来し、唯一の四つ（1.5％）は淡水からである（追加ファイル1：図S1A）。

驚くべきことに、エピリムニオン試料は、”SL56marine group”（caまで）に所属する配列によって支配されていた。 全原核生物コミュニティの5％）。 シルバのSL56関連配列は、淡水湖とグローバルオーシャンシリーズデータセット（GOS）から回収されています。 しかし、それらが記載されたGOSサンプルは、実際には淡水データセット、ガトゥン湖（パナマ）です。 これは、我々の結果から非常に明白である（図。 1;追加ファイル1: 図S2)このクラスターは一貫して湖、貯水池、河川にのみ見られ、海洋生息地には見られないことから、誤って”海洋グループ”と呼ばれていることが示唆されて”多様な環境（ウラン採掘廃杭、土壌、淡水、海洋水柱、および堆積物）から記載されたJG30-KF-CM66と呼ばれる配列の別のグループは、湖よりも川（特にアマゾン川）に優先的に分布していることが判明した（図。 非常に低い存在量（全原核生物の最大１％）ではあるが、図１Ａ、ｂ）に示すように、非常に低い存在量（全原核生物の最大１％）である。 同様の存在量は、汽水カスピ海（深さ40mと150m）で発見された（追加ファイル1：図S2）。

しかし、調べたすべての淡水メタゲノムデータセットでは、SAR202クラスターまたはその淡水姉妹クレードCL500-9の存在を支持するものは見つかりませんでした。 海洋および汽水の生息地では、SAR202は原核生物のコミュニティの30％までを占める暗いaphotic層でほぼ独占的に発見されています。 淡水生息地にSAR202関連のクレードがある場合、それらは確かにあまり豊富ではないか、おそらく元の報告書の水柱に由来していない（追加ファイル1：図S1）。 全体的に、淡水エピリムニアにおけるクロロフレキシの相対的な存在量は、より深い水域よりもはるかに低いにもかかわらず、それらは新しいグループの豊富で広範なコレクションに家である。

これらの観察により、ここで調べた水生環境（淡水、汽水、海洋）では、クロロフレキシの代表者の多様性が大幅に異なり、淡水環境は汽水または海洋のいずれかよりも系統学的に多様なグループを保有していることも容易に明らかである。 また、淡水のみのグループの存在のための明確な証拠があります（例えば、SL56）および海洋および汽水のみのグループ（SAR202）は、塩分が淡水と海洋生態系の間の微生物生息地の移行に対する障壁であることを繰り返している。 これは、淡水から海洋への比較的最近の移行（例えば、淡水”Ca. Methylopumilus spp.”と海洋OM43）と逆に（海洋Pelagibacterと淡水LD12）の両方が提案されています。 しかし、汽水環境で見つかったグループは、おそらくより成功した進出のために単により良い”下塗り”することができる可能性があります。 我々は、淡水および汽水メタゲノム（JG30-KF-CM66およびCL500-11）に存在するグループの例を見つけるのですか。

主要な淡水クロロフレキシの代表者

は、14の異なる環境（28の湖/貯水池、26の河川、および3つの汽水データセット）に属する各57データセットの集合からクロロフレキシ関連の連続体の自動ビニングにより、合計で102MAGs（メタゲノム組み立てゲノム）の分離をもたらした（追加ファイル2：表S1）。 30％以上の完全性（n=53）を有するMAGsの系統解析は、実質的にすべてのよく知られているChloroflexiクラスから著しく高い多様性のMAGsが回収されたことを示してい 2). 三十から五MAGsは、利用可能な培養代表（SL56、TK10、およびJG30-KF-CM66）なしで三つの別々の新規クラスレベルの系統を構成しました。

触媒レポーター沈着（CARD-FISH）に続いて蛍光in situハイブリダイゼーションは、冬の部分的なmixis中にチューリッヒ湖エピリムニオンでCL500-11細胞の高い数を検出したが、ピーク び琵琶湖（最大１ ４％；図３Ａ）および琵琶湖（最大１ ４％；図３Ｂ）を含む。 3d）。 CL500-11の豊富さは温度およびクロロフィルaの集中両方と否定的に相関しました（付加的なファイル1: 図S3)。 しかし、シモフ貯水池のサンプルでは、CL500-11は検出限界（<0.18％）を下回っており、この比較的浅い生息地（最大深さ43m）はこの細菌群にとって好ましいニッチを表さないことを示唆している（追加ファイル1：図S4）。 ＣＬ５ ０ ０−１ １細胞は、以前にＣＡＲＤ−ＦＩＳＨによって視覚化され、大きく湾曲した細胞であることが示されている。 同様の形状とサイズは、0.92μ m（範囲0.4–1.6μ m;n=277）の平均長さと0.28μ m（範囲0.19–0.39μ m）の幅を持つチューリッヒ湖からの魚のサンプルで観察された。 細胞体積を分析する（中央値0。すべての原核生物と比較して、このクラスターのバイオマス（図06μ m3）およびバイオマス（図06μ m3）を参照してください。 3c)は、総微生物バイオマスに対するCL500-11集団の非常に高い寄与を示唆している。 それらのバイオマス対存在比はほぼ2であり、すなわち、10％の存在量で、それらは総原核生物バイオマスのほぼ20％を占め、比較的乏栄養性の深いhypolimnionに顕著な適応を示し、大きな細胞サイズでも高い集団を達成している。

11等（淡水10、汽水1）をCL500-11で合計で回収した。 異なる月からの琵琶湖の四つのマグはすべて単一の種を形成する。 しかしながら、チューリッヒ湖からの二つの種は、一つの種がミシガン湖からの前述のMAG（CL500-11-LM）と一緒に分岐し、汽水カスピ海（>95%ANI）と同様のメタゲノムフラグ および４ｃ）。 候補属Profundisolitarius(Pro.fun.di.so.li.ta’)を提案しますri.us.L.adj.profundus deep;L.adj.solitarius alone;N.L.masc. n. Profundisolitarius Candidatus Profundisolitariaceae fam内の深い）からの唯一の世捨て人。 【送料無料】【 CL500-11集り（クラスAnaerolinea）のため。

一方、SL56グループは、シモフ貯水池の支配的な系統である（最大1。１ ６Ｓ ｒＲＮＡおよびＣＡＲＤ−ＦＩＳ ｈ分析の両方による（図１および図２）。 1および3）。 最大存在量は、caの温度で約5-20mでほぼ常に発見された。 15°C,このグループは、主にepilimneticであることを示唆しています(追加ファイル1:図S3とS4). 水柱（水温躍層）のこの領域は、温度勾配を有することとは別に、表面層と比較して有意に低い光強度を有する。 チューリッヒ湖の成層夏のプロファイルにおける約13mの深さにおける低光適応cyanobacterium Planktothrix rubescensのピーク存在量は、SL56の最大存在量と一致する（追加ファイル1：図S3）。 SL56細胞は棒状で伸長している(平均長さ=0.68±0.25μ m;平均幅=0.35±0.09μ m;n=6;図10A)。 3e）。 我々の知る限りでは、これはepilimnionで繁栄するように見える淡水特異的Chloroflexiグループの最初の報告です。

SL56クラスター(1個に16S rRNAが含まれている)について合計14Magが回収され、クラスレベルの系統を形成し、既知のすべてのChloroflexiからかなり分岐しました(図1)。 2). 彼らの唯一の親戚は、帯水層の堆積物から記載された単一のMAG（Chloroflexi CSP1-4）です。 CSP1-4が関連すると報告されている16S rRNAクレードはGitt-GS-136であり、このクレードの配列の大部分は土壌または河川の堆積物のいずれかに由来する（シルバ分類学からの情報）。 しかし、我々はCSP1-4の利用可能なゲノム配列内の任意の16S rRNA配列（部分的または完全）を検出することができませんでした。 Gitt-GS-136およびSL56に次に近いクレード（16S rRNA分類学において）はKD4-96であり、その配列は同じ生息地から得られた（追加ファイル1：図S1B参照）。 加えて、ＳＬ５ ６群からの全ての既知の１ ６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、淡水（ガトゥン湖、チューリッヒ湖など）のみに由来する。). まとめると、淡水SL56系統の最も近い系統発生の親戚が土壌や堆積物の生息地に生息するように見えます。

SL56Magは地理的に離れた場所から再構築された（ヨーロッパ、南北アメリカ、図。 ることができた（ＡＮＩ、図２）。 1). 琵琶湖のサンプルからMAGsは得られなかったが、三つの16S rRNA配列は、非結合contigsで取得されました。 再構成されたマグマは、エピリムニオンからの淡水データセットに沿って大域的に分布している（深部低カリウムイオンでは検出されない）（図。 図4および追加ファイル1:図S6)。 カスピ海からはSL56Magは再構築されず、回収されたゲノムは汽水メタゲノムから募集されなかった。 Ｌｉｍｎｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属（Ｌｉｍ．ｎｏ．ｃｙ．ｌｉｎ’ｄｒｕｓ．Ｇｒ．）の候補属を提案した。 フェム n.limne a lake;L.masc. n. cylindrus a cylinder;N.L.masc. n.Limnocylindrus Limnocylindraceae fam内の湖からのシリンダー）。 【送料無料】【,Limnocylindrales ord.nov.、およびＬｉｍｎｏｃｙｌｉｎｄｒｉａ ｃｌａｓｓｉｓを含む。 【送料無料】【 Chloroflexi SL56クラスターのために。

Tk10 16S rRNA配列は、琵琶湖ハイポリムニオン試料で最も高い存在量で発見された（最大ca. 2％）（図2）。 1a、c）。 細胞は、1.08±0.1μ mの推定長さおよび0.84±0.09μ mの幅を有する卵形であった（n=12；図12a）。 3e）。 16S rRNA追加ファイル1を含む三つのMagのコヒーレントクラスタ: 図S1)地理的に離れた場所(ヨーロッパ、アジア、北米)から回収されました。 より深い湖の層で繁栄しているこれらの著しく国際的な生物はあまり多様ではありません（ANI値>95％）。 この明らかな低い多様性は、非常に専門的なニッチの結果であるか、またはより可能性の高いものである可能性があり、”Ca”に似た比較的最近の淡水への “Fonsibacter”（LD12Alphaproteobacteria）。 SILVAデータベースのいくつかの16S rRNA配列は、海洋堆積物および水柱から得られているが、海洋または汽水メタゲノムでは16s rRNAの代表者は検出されなかった（追加ファイル1：図S1）。 16S rRNAからの最も近い親戚は、これらが元の生息地である可能性があることを示唆している土壌または堆積物サンプルからのいずれかであるよう 興味深いことに、TK10クラスターは、大規模でChloroflexiの系統樹のSL56とCSP1-4の後にのみ、深い分岐であり、他のすべてのChloroflexiの代表（MAGsまたは単離ゲノム）は、これらの両方 候補属ウンブリシクロプスを提案します(Um.bri.cy’clops.L.fem. N.umbra shadow;L.masc. n.cyclops(Gr. 円形の目;Cyclops）サイクロプス;N.L.masc。 ウンブリシクロプス（Umbricyclops）は、ウンブリシクロプス科ウンブリシクロプス属に分類される鳥類の一種である。 【送料無料】【、ウンブリシクロパレスオード.nov. およびＵｍｂｒｉｃｙｃｌｏｐｉａ ｃｌａｓｉｓ ｎｏｖ． 生物のこのグループのために。＜5725＞＜8092＞カードフィッシュの結果は、JG30-KF-CM66細胞が0.56μ m（±0.15μ m;n=8;図5）の推定直径を有する球状であることを示している。 しかし、チューリッヒ湖およびシモフ貯水池の深さプロファイルでは、JG30-KF-CM66について非常に低い割合（<0.28％）が観察された（追加ファイル1：図S3およびS4）。 我々は、主に深海の柱（八汽水、四淡水）から12等を得た、ほぼ完全な16Sシーケンスを持つもので、系統解析で新しいクラスレベルの系統を形成した（図。 1). これらのマグマの最も近い親戚は、海洋SAR202とDehalococcoideaである（Fig. 図1および追加ファイル1：図S1）。 このクラスター内では、汽水性のマグマと淡水性のマグマの異なるグループを区別することができます。 候補属Ｂａｔｈｏｓｐｈａｅｒａ（Ｂ ａ．カントースファエラ Gr. (形)bathos deep;L.fem. n.sphaera a sphere;N.L.fem. bathosphaera Bathosphaeraceae fam内の深い）に住んでいるコクコイド細菌。 【送料無料】【、バソスファエラレスord.nov。、およびBathosphaeria classis。 【送料無料】【 Chloroflexi JG30-KF-CM66の集りのため。

また、Chloroflexia(4等)とCaldilineae(2等)のクラスでもMagを回収しました(図1)。 1). クロロフレキシアマグは、中温性Oscillochloris trichoides DG-6亜目Chloroflexineae（一つのMAG）とKouleotrichaceae famのKouleothrix aurantiacaに他の三つのMagに関連していた。 【送料無料】【 Ｋｏｕｌｅｏｔｈｒｉｃｈｎｉａｅサブオーダーという名前を提案した新しいサブオーダーを形成した。 【送料無料】【 これらのMagはいずれも、起源の場所を除いて重要な断片の募集を示していません。 カスピ海からの追加の14等は、すでに記載されているように、ここではさらに議論されないSAR202クラスターに所属しています。

生態系機能における淡水クロロフレキシの寄与

再構築されたクロロフレキシマグ（完全性≥30％）への代謝的洞察は、ロドプシン（CL500-11、Chloroflexales、SL56、TK10）または好気性無酸素性光栄養症（Chloroflexales）のいずれかを介して光駆動エネルギー生成によって増強される主に従属栄養性の生活様式を示唆している。 各クラスターのＭａｇは，解糖，糖新生，トリカルボン酸サイクルなどの中心的な炭水化物代謝に必要な遺伝子を含んでいる。 同化硫酸還元（3′-ホスホアデノシン5′-ホスホ硫酸塩（PAPS）シンターゼと硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）のためのキー遺伝子は、外因性の還元硫黄化合物の利 脱窒遺伝子（硝酸レダクターゼ/亜硝酸塩オキシドレダクターゼαおよびβサブユニットおよび亜硝酸塩レダクターゼ）は、TK10MAGsで発見されたが、分子窒素の産生

水生環境では、ThaumarchaeotaとCyanobacteriaは、栄養要求栄養生物の大規模なコミュニティまたはサルベージが可能な少数のためのコバラミンとそのコリノイド前駆体の主な源 コバラミンのデノボ合成は代謝コストが高く、ブラッククイーン仮説は少数のコミュニティメンバーだけがその生産を行う理由の説明として提唱されている。 再構築されたChloroflexi MAGsのいずれもゼロからコリンリング生合成に必要な遺伝子をコードし、高親和性コバラミン（BtuBFCD）または他の疑われるコリノイド（DET1174-DET1176）トランスポーターもゲノムの不完全さや記載されていないトランスポーターの使用の結果である可能性が欠落していた。 しかし、jg30-KF-CM66クラスターのMAGsは、コバラミンを合成するためにリボフラビン生合成経路からの中間体と一緒に輸入コリノイドを利用するコバラミン ZH-クロロ-G3MAGには、ほぼ完全なコバラミンサルベージ（CobCのみが欠落している）とリボフラビン生合成経路が含まれています（追加ファイル3：表S2）。＜5725＞＜8092＞鞭毛集合遺伝子は、CL500-11およびTK10クラスターのいくつかのMAGsに存在した（図。 1および追加ファイル3:テーブルS2)。 しかし、外膜に鞭毛を固定するL-およびP-リング成分は、すべての鞭毛MAGsおよび参照Chloroflexiゲノム（例えば、Thermomicrobium、Sphaerobacter）に欠けていた。 さらに、Ｍａｇｓおよび参照Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉゲノムは、ＬＰＳ生合成のための遺伝子をコードせず、ＳｅｃおよびＴａｔ以外の分泌系は検出されなかった（外膜に固定されているｉ−ＩＶ型分泌系は まとめると、利用可能なChloroflexiゲノムの比較ゲノミクスは、電子顕微鏡写真は、この門のほとんどのメンバーで二つの電子密な層を示唆しているが、Chloroflexiは可能性が高い単一の脂質膜（単胚葉）ではなく、二つの（diderms）を持っていることを推論を強化します。

ロドプシン様配列は、キサントルホドプシンに系統発生的に最も近いCL500-11、クロロフレキシア、SL56、およびTK10の代表者から本研究の18MAGsで認識された（追加ファイル1: 図S8AおよびB）、および他の淡水および沿岸ロドプシンと同様の緑色光を吸収するように調整されている（追加ファイル1：図S8C）。 いくつかのMAGsはカロテノイド生合成のための遺伝子をコードし、キサントルホドプシンの特徴であるカロテノイドアンテナの可能性を可能にする。 結合サリニキサンチン（Salinibacter ruberの優勢なカロテノイド）に関与する残基のうち、我々は保存された驚くほど高い数を発見した（少なくとも1つのロドプシンシーケンスの10のうち12の同一）（追加のファイル1: 図S8D）は、カロテノイドアンテナが結合している可能性があることを示唆しており、これらの配列の少なくともいくつかは真正なキサントルホドプシンである。

層別化中に主にhypolimnionに見られるCL500-11およびTK10の代表者でさえ、光栄養が可能ですが、冬と早春のmixisの間に光ゾーンにアクセスする可能性があります。 ロドプシンベースの光ヘテロ栄養から離れて、我々はまた、光化学系II型反応中心タンパク質LとM（pufLとpufM）、バクテリオクロロフィル、およびカロテノイド生合成のための遺伝子をコードするクラスクロロフレキシアのMAGsを取得しました。 PufM遺伝子配列は、他のChloroflexi関連pufM配列と一緒にクラスター化される(追加ファイル1:図S9)。 しかし、3-ヒドロキシプロピオン酸経路またはカルビン–ベンソンサイクルのいずれかを介して炭素固定の証拠は、MAG不完全性の結果である可能性があ また、これらは炭素を固定しない好気性無酸素性光栄養生物、例えば淡水ゲンマチモナデテスおよびアシドバクテリア（両方とも好気性）である可能性がある。

遠洋性Chloroflexiの進化史

この研究で回収されたChloroflexi門の代表者のコレクションは、分離株およびMAGsからの既存のゲノム配列とともに、大規模な門の複雑な進化史の部分的なスケッチのみを提供していることは、系統解析から明らかである。 例えば、最も発散する枝”Ca. “Limnocylindria”（SL56クラスター）と”Ca. Umbricyclopia”（TK10クラスター）は、帯水層堆積物MAG（”Ca. リムノシリンドリア”）。 しかし、関連する16S rRNAクローンは、遠洋ライフスタイルへの移行を示唆し、これらのグループの両方の土壌/堆積物から回収されている（追加ファイル1：図S1B）。

これらのグループの関連する海洋16S rRNA配列の欠如を考慮すると、海洋メタゲノムデータセットでの検出不能性に加えて、生理食塩水環境ではなく土壌/堆積物からの祖先も示唆されている。 海洋起源の可能性は正式に排除することはできませんが、土壌/堆積物から淡水水柱への移行の方向性が最も可能性が高いようです。 また、”Ca. “Limnocylindria”と”Ca. Umbricyclopia”クラスDehalococcoideaと海洋SAR202の発散の前に発散する（クラス”Ca. モンストラマリア”）は、まだ知られている唯一の生態学的に関連する海洋クロロフレキシ（海洋堆積物の前者と深海水柱の後者）であり、祖先のクロロフレキシは土壌/堆積物の生息地に由来する可能性が高い。 深海における海洋SAR202の成功は顕著であり、地球上で最も広く分布し、おそらく最も豊富なChloroflexiグループである。 しかし、その最も近い親戚、Dehalococcoideaからのいくつかの16S rRNA配列は、大部分が深い海洋堆積物（両方の無酸素生息地）からであるように見えるにもかかわらず、淡水