Frontiers in Physiology

はじめに

タイトジャンクションタンパク質ファミリーは、例えば内耳に示されているように、多くの器官および組織の疾患および機能不全に関連しているため、細胞生理学にとって重要である(Wilcox et al. 2001年;Florian et al. ら、２ ０ ０ ３）、腎臓（Ｋｏｎｒａｄ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ６；Ｇｕｎｚｅｌら，２ ０ ０ ６；Ｇｕｎｚｅｌら， ら、２ ０ ０ ９）、消化管（Ｒｅｓｎｉｃｋ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ５；Ａｍａｓｈｅｈ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ９）、表皮（Ｆｕｒｕｓｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2002; Tebbe et al. ら、２ ０ ０ ２）、および脳毛細血管（Ｎｉｔｔａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ３；Ｗｏｌｂｕｒｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003). Claudinsは、少なくとも27のメンバーを含む膜貫通タンパク質ファミリーを表す(Mineta et al., 2011). それらの４つの膜貫通ヘリックスドメインに加えて、それらは、２つの細胞外ループ（ＥＣＬ１およびＥＣＬ２）、短いＮ末端およびＣ末端を含む（Ｓｕｚｕｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). 特定のクローディンの発現パターンを決定し、上皮の選択的透過性を反映し、claudinタンパク質のcis（同じ膜内）とtrans（隣接する細胞の膜間）で相互作用する能力は、バリア形成と細孔形成タイトな接合ストランドの形成を可能にする（Van Itallie and Anderson、2006）。

クローディン-5は血管内皮で強く発現し、他のクローディンと比較して発現が>100倍高いため、血液脳関門（BBB）のタイトジャンクション（TJ）を支配している（Ohtsuki et al., 2007). さらに、それは、肺（Ｓｏｉｎｉ，２ ０ １ １）、外分泌組織（Ｃｏｍｐｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ １ １）を含む種々の上皮組織で発現される。 ら、２ ０ ０ ９）、腸（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ７）、および尿路（Ｋｏｄａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011). しかしながら、claudin-5は、他の組織よりも脳毛細血管において強い障壁を引き起こし（ReinholdおよびRittner、2017）、その機能は神経変性および神経炎症性障害において損, 2019). したがって、claudin-5はBBBを維持するために重要です。 しかし、BBBは保護的であるだけでなく、薬物がこの障壁に浸透するのを妨げるため、治療選択肢も制限します。

新田ら （２ ０ ０ ３）は、ＢＢＢが、野生型マウスと比較して、クローディン−５欠損マウスにおいて、サイズが８ ０ ０Ｄａの分子に対してより透過性であることを報告している（Ｎｉｔｔａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003). これは、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層におけるｃｌａｕｄｉｎ−５の封止効果を実証するトランスフェクション実験に従った（Ａｍａｓｈｅｈ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2005).

もう一つの主要な障壁を形成するclaudinはclaudin-3であり、電荷と非荷電溶質のいずれかのイオンの通過に対して障壁を選択的にシールすることが報告されている(Milatz et al., 2010). それはまた、脳毛細血管の内皮タイト接合部で発現され、その機能的損失は、多発性硬化症を有する患者の微小血管炎症、神経膠芽腫および脈絡叢の相 ら、２ ０ ０ １；Ｗｏｌｂｕｒｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003).

バリアプロパティは、次のように動的に変更できます。 ヒト腸細胞株Ｈ Ｔ−２ ９／Ｂ６における経上皮電気抵抗を迅速かつ可逆的に減少させることが実証された（Ｋｒｕｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013). カプレートナトリウムは、上皮細胞および内皮細胞のタイトな接合部で一過性にクローディン-5含有障壁を開放する（Del Vecchio et al., 2012).

これは、claudin-5がBBBにおける薬物送達増強の有望な標的であることを示している。

本研究では、アフリカツメガエルlaevis卵母細胞の異種発現系を採用することを目的とした（Vitzthum et al. ら、２ ０ １ ９）ｃｌａｕｄｉｎ−５およびｃｌａｕｄｉｎ−３相互作用および過チュービングの分析のためのものである。 内因性細胞-細胞-接触の欠如のために、この単一細胞発現システムは、他のタイトな接合タンパク質の干渉なしに特定のクローディンの分析を可能に

材料と方法

卵母細胞の収穫とcRNA微小注入

卵母細胞は、外科的開腹術によって成体の雌アフリカクローガエルから収集されました。 アナステシアの場合、0。２％ＭＳ２ ２ ２（ｅｔｈｙｌ３−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を浴溶液として２ ０℃で５〜１ ０分間使用した。 ５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ ＢＰ２ ６ ４ ９−１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｃｈｗｅｒｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、室温で９ ０分間酵素消化により卵母細胞の単離を行った。 (2019). 濾胞細胞を、（ｍ Ｍで）：Ｎａｃｌ（９ ０）、Ｋｃｌ（１）、ＥＧＴＡ（トリエチレングリコールジアミン四酢酸）（１）、５ＨＥＰＥＳ（５）；５ ０ｒｐｍの機械的シェーカー上で１ ０分間、Ｃａ２＋を含まないＯｒｉ中でインキュベーション 第Ｖ期および第ＶＩ期（＜４ ０ ４＞１ ０ ０ ０μ Ｍ）の卵母細胞に、対照としてヒトクロージン−５、クロージン−３またはＲｎａｓｅをコードする１ｎｇのｃＲＮＡを注入した（Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ２ ０ １ ０，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｅｓｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）。 注入量は卵母細胞あたり50.6nlであった。 注射後、卵母細胞を16℃でORiで3日間インキュベートし、タンパク質発現させた。

膜画分の単離と免疫ブロッティング

十注入卵母細胞は、ウェスタンブロット分析のためにプールされ、（mMで）Mgcl2（5）、Nah2Po4（5）、EDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）（1）、スクロース（80）、およびトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（20）を含む500μ lの均質化緩衝液に再懸濁させた。7.4. 卵母細胞抽出物を２ ０ ０ｒｐｍで４℃で１ ０分間２回遠心分離して、細胞残屑を廃棄した。 上清を１ ３，０ ０ ０ｒｐｍで４℃で３ ０分間遠心分離して、Ｌｅｄｕｃ−Ｎａｄｅａｕら（１ ９ ９ ８）によって記載されたように細胞膜をペレット化した。 (2007). ペレットを８ ０μ ｌの均質化緩衝液中に再懸濁した。 タンパク質定量は、Ｐｉｅｒｃｅ６ ０ ０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、９ ６ウェルプレート中の製造業者の説明書に従って、比色測定的に行った。 プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ Ｅｎｓｐｉｒｅ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を５ ６ ２ｎｍに調整し、１ ２ ５〜２ ０ ０ ０μ ｇ／ｍｌの範囲のウシ血清アルブミン標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を評価のために用いた。 免疫ブロッティングの前に、試料を４×ＬＡＥＭＭＬＩ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、１ ０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動した。 タンパク質移動のために、ＰＶＤＦ膜を使用し、１ ２ ０分間、トリス緩衝生理食塩水中の５％非脂肪乾燥乳中で遮断した。 タンパク質は、ｃｌａｕｄｉｎ−３またはｃｌａｕｄｉｎ−５に対して産生させた一次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃３ ５−２ ５ ０ ０、＃３ ４−１ ７ ０ ０、＃３ ４−１ ６ ０ ０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を用いた免疫ブロッティングによって検出した。＜１ １ ３＞＜３ ５ １ ６＞ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギおよび抗マウス抗体（＃７ ０ ７ ４、＃７ ０ ７ ６Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍ Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して一次抗体に結合し、したがって室温で最低４ ５分間 検出のために、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（＃１ ７ ０ ５ ０ ６ １，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｇｍｂｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、シグナルをＣｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって可視化した。＜１ １ ３＞＜２ ０ ７ ５＞免疫組織化学＜９ １ ０ ５＞＜３ ５ １ ６＞注入された卵母細胞を４％ＰＦＡ（１ ６％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，Ｅ１ ５ ７ ０ ０，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に室温で４時間固定し、続いて７ ０％エタノールからキシロル（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へミクロトーム（leica microsystems heidelberg,Germany）。 免疫組織化学的処理の直前に，パラフィンをキシロールを介してエタノール勾配に除去した。 非特異的結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水中の5％ヤギ血清を使用してブロックされ、免疫ブロッティングと同じ一次抗体とインキュベートされた。 試料を、二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４ ８ ８ヤギ抗ウサギおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５ ９ ４ヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）とインキュベートし、共焦点レーザー走査免疫蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７ １ ０，Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調

凍結破壊電子顕微鏡

凍結破壊電子顕微鏡は最近報告されたように行われた(Greene et al., 2019). 固定のために、注入された卵母細胞をグルタルアルデヒド（2.5％in0.1M cacodylate buffer）中で4℃で一晩インキュベートした。cacodylate bufferで洗浄した後、卵母細胞を凍結破砕のために調製した。 試料を30％グリセロール中で凍結保護し、液体窒素中で凍結した。 破砕し、白金および炭素（ＢＡＦ４ ０ ０Ｄ；Ｂａｌｚｅｒｓ，Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）でシャドーイングした後、残留する有機材料を次亜塩素酸ナトリウム洗浄によって除去した。 卵母細胞を透過型電子顕微鏡（ＥＭ−１ ０，Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析し、デジタルカメラ（Ｔｒｏｎｄｌｅ Ｇｍｂｈ）で撮影した。 タイトな接合ストランドの形態計測分析は、20,000×の倍率で行われました。

対卵母細胞アッセイと接触領域の定量

マンニトールは、注入された卵母細胞を縮小し、原形質膜を損傷することなく鉗子を使用してビテリン膜の機械的除去を可能にするために実施された。 ５〜１ ０個の卵母細胞を、Ｏｒｉを充填したペトリ皿（直径３ ５ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ，＃１ ５ ３ ０ ６ ６）に入れた。 マンニトールを添加し、細胞の高張収縮が達成されるまで溶解した（約４ ０ ０ｍＯｓｍｏｌ／ｌ、１ ０分間）。 手動脱vitellinisation後、卵母細胞はすぐに24ウェルプレートに転送されました(1. ８ ６ｃｍ２表面積、ＴＰＰ Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，＃９ ２ ０ ２ ４）２ｍｌのＯｒｉを含有する。 各ウェルにおいて、２つの細胞を、Ｐａｓｔｅｕｒピペット（１ｍｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ，＃ＰＰ８ ８ＳＢ）および球根状プローブと共に押し出すことによって、穏やかにクラスター化した。＜１ １ ３＞＜３ ５ １ ６＞クローディン−５発現（ｃｌｄｎ５−ｃｌｄｎ５）、クローディン−３発現（ｃｌｄｎ３−ｃｌｄｎ３）、クローディン−３およびクローディン−５共発現（ｃｌｄｎ３，５−ｃｌｄｎ３，５）および対照卵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ−ｃｏｎｔｒｏｌ）の卵母細胞対を、１ ６℃でＯｒｉで最大４ ８時間一緒に保った。＜１ １ ３＞＜３ ５ １ ６＞明視野顕微鏡法を用いた。２ ４ウェル培養皿中のナイーブ卵母細胞対の画像を、これらの時点で、ｌｅｉｃａ ｄｍｉ６ ０ ０ ０Ｂ顕微鏡（ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して撮影した。 接触面積の直径は、ミクロンスケール（LAS-AF3.2.0）を用いて測定した。 接触面積は円形であるとみなされ、したがって、接触面積は円方程式A=√r2を使用して計算された。

静水圧インパルスアッセイ

ビテリン膜は、前に説明したように機械的に除去され、卵母細胞は対の卵母細胞アッセイに類似してクラスター化された。 さらに、混合卵母細胞対（対照−ｃｌｄｎ５および対照−ｃｌｄｎ３）を静水圧インパルス（ＨＰ Ｉ）アッセイで試験した。 ２ ４時間の安定化の後、単一チャネル電子ピペット（ＥＥ−３ ０ ０Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏ，ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２．

卵母細胞を2mlのORiを含む24の井戸プレートに保持し、ピペッティング容量250μ lのORiを適用する前に中央の位置決めをチェックしました。 分配の速度は0.9s.の分配の速度を同等にする最高速度にuniformely置かれた。 周囲圧力，Orｉの粘度およびピペット先端開口部の直径を一定条件下に保った。 明視野顕微鏡は、静水圧が適用され、適用前に接触領域と比較された30分後に接触領域の定量のために採用された。 実験のセットアップについては、図1を参照してください。

水を注入した対照卵母細胞の接触面積は、24時間後に129％、48時間後に150％に増加した。 Claudin-3を発現する卵母細胞のクラスター化されたペアはまた、147％（24h）と162％（48h）に接触面積の増加を示した。 Claudin-3とclaudin-5を共発現する卵母細胞のクラスター化されたペアは、168％（24h）と209％（48h）の接触面積を示した。 Claudin-5単独で発現する卵母細胞のクラスタ化されたペアは、120％（24h）と127％（48h）の接触面積を示した。 従ってすべてのテストされた組合せの接触域は対等でした。

静水圧インパルスアッセイは、卵母細胞のペアのクローディン特異的な接合部を明らかに

別のアプローチでは、クローディン-3またはクローディン-5を発現するか、両方のクローディンを共発現する卵母細胞は、機械的デビテリン化後にクラスター化された。 卵母細胞を、ＨＰＩを用いることによって挑戦し、接触面積を測定し、挑戦の３ ０分後に計算し、２ ４時間の安定化期間後の初期面積と比較した（図５および表２）。 静水圧チャレンジ後、水注入コントロール卵母細胞の接触面積は89％に減少した。 クローディン-5、クローディン-3を発現する、またはクローディン-3とクローディン-5を共発現する卵母細胞のクラスター化された対は、より大きな接触領域を保持した（97％、p=0.0235;96％、p=0.003;98％、p=0.0253）。 混合水注入対照卵母細胞およびクローディン発現卵母細胞（対照-cldn5および対照-cldn3）の接触面積は、対照卵母細胞（93％、p=0.2900;83％、p=0.4455）と有意に異ならなかった。＜113＞＜8021＞表2

Caprateとのインキュベーション

パイロットインキュベーション実験では、卵母細胞を注入し、クローディン-5（cldn5–cldn5）を発現するか、RNAse遊離水を対照（対照–対照）として注入した。 対は50、100、または500μ mの最終的なナトリウムカプレート濃度でインキュベートした。 卵母細胞対のreferenceｉとのインキュベーションは参照群として役立った。 卵母細胞をクラスター化し、24時間の安定化の後、インキュベーションを開始し、接触幅を添加後30、60、および120分測定した（補足図S1）。

ORiの添加は、添加後60または120分に分散しているクローディン発現および水注入卵母細胞対の両方における接触面積の初期減少をもたらした。 これは、時間の経過に伴う中央接触領域間の接続線の放物線形状によって概説される（補足図S1の赤い曲線）。 しかし、100および500μ mナトリウムカプレートとのインキュベーションは、わずかに（100μ m）または強く（500μ m）30分カプレート添加後5.1×105から5.2×105μ m2および4.3×105から4.9×105μ m2に接触面積を増加させた。

ディスカッション

本研究では、トランスポーターとヒト疾患モデリングのための古典的なモデルを採用しました（Tammaro et al. ら、２ ０ ０ ９；Ｎｅｎｎｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ９）、ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞、クローディン−５相互作用および接合部シールへの機能的寄与の詳細な分析のためのものである。 この目的のために、クラスター化アフリカツメガエル卵母細胞の接触領域内の挑戦的な相互作用のためのHPIを導入する新しいアプローチが確立され

クローディンは、Vitzthumらの以前の結果によると、より強い接着特性に寄与する

。 (2019)では、卵母細胞で発現された単一のクローディンは、対照卵母細胞と比較して相互作用接触面積の増加をもたらさなかった。 しかし，免疫ブロットと免疫組織化学的可視化は，ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞原形質膜への発現と統合に成功したことを証明した。 さらに、共焦点レーザー走査顕微鏡の使用は、ピンホールが焦点外蛍光をブロックするように原形質膜に発現クローディンの正確な局在化を可能にした。 標的との結合に対する抗体の親和性が異なるため、免疫組織化学的シグナルの定量化は追求されなかった。

Vedula et al. (2009)は、gfpタグ付きオクルジン、cldn-1、およびcldn-2をトランスフェクトしたL-線維芽細胞を使用してclaudin-claudin相互作用の側面を調査するためにマイクロピペット吸引 互いに二つの細胞をデタッチするために必要な分離力は、cldn-1とcldn-2トランスフェクト細胞（それぞれ≥2.8と2.3nN）で大きかった。 このアプローチは、卵母細胞を発現するクローディン-クローディン相互作用解析のためにも有望なように見えるかもしれないが、予備試験は、クラスタ化された卵母細胞の剥離は、卵母細胞の原形質膜の破壊なしには不可能であることを明らかにした。

したがって、新しいアプローチとして、接続の力をHPIによって測定しました。 HPIは絶対値の分離力の定量化を提供しないが（例えば、ニュートンの）、他の堅い接続点蛋白質の妨害なしでclaudinの相互作用の速く、費用効果が大きい分析をallowes、オクルジン、トリセルリン、ジャム-A）。 Claudinsはhpiの後で水注入された卵母細胞と比較されるより大きい接触域を示すので卵母細胞の対の接続点に貢献します。 これは、クローディン発現細胞間の強いホモ親和性トランス相互作用を示しています。

ストランドフィブリルアーキテクチャは単一クローディンに特異的である(Colegio et al., 2002). 凍結破壊電子顕微鏡では、クローディン-3は、アフリカツメガエル卵母細胞におけるループ形状で、より丸みを帯びたストランドメッシュワークを組み立てることが報告された（Vitzthum et al., 2019; 図3B）私たちの研究では、claudin-5はより角度のあるメッシュワークを形成し、行に並んでいました。 画像は、タイトな接合タンパク質claudin-5は、x.laevis卵母細胞の不連続、角度の形の行にフィブリルのメッシュワークを形成することを明らかにした。 これは、ｐ相に関連する粒子の鎖として生じることが知られているクローディン−５鎖に従う（Ｐｉｏｎｔｅｋ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011). 実験では，フィブリルの幾何学的形状は卵母細胞の接着特性に影響を及ぼさないと考えられた。 それによれば、傍細胞抵抗性は、原線維数および原線維形成特性とは無関係であることが報告された（Colegio et al., 2002). さらに、ｃｌａｕｄｉｎ−３およびｃｌａｕｄｉｎ−５は、ＨＥＫ２ ９ ３細胞において同族性ｔｒａｎｓ−相互作用について同様の能力を有することが示されている（Ｐｉｏｎｔｅｋ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011).

単一のタイトジャンクション蛋白質を発現するX.laevis卵母細胞のこのモデルは、クラスター化された卵母細胞間の接触領域の形成に及ぼすカプレートナトリウムカプレートのような物質の影響を観察することを可能にする。 従ってそれは堅い接続点の障壁に影響を与える物質の時間そしてコスト効率が高いスクリーニングに有用な用具を提供するかもしれません。

100および500μ mのナトリウムカプレート濃度は、インキュベーションの30分後に接触面積を増加させる、その結果、卵母細胞を発現するクローディン-5に保護効

Krug et al. (2013)は、カプレートナトリウムとのインキュベーションは、ヒト腸細胞株HT-29/B6における経上皮抵抗の急速かつ可逆的な減少につながったことを実証した。 さらに、共焦点レーザー走査顕微鏡は、中鎖脂肪酸ラウリン酸で処理したＨ Ｔ−２ ９／Ｂ６細胞におけるクローディン−５の顕著な減少を明らかにした（Ｄｉｔｔｍａｎｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). クローディンの第１の細胞外ループ（ＥＣＬ１）は、タイトジャンクションの障壁特性にとって重要であり、第２の細胞外ループ（ＥＣＬ２）は、トランス相互作用の鎖形成に関 ら、２ ０ ０ ８；Ｒｏｓｓａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｇｒｅｅｎｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2019). Ｅｃｌ１またはＥＣＬ２を標的とするｃｌａｕｄｉｎ−５結合剤は、タイトジャンクション蛋白質の細胞内取り込みを誘導し、それにより、隣接する細胞間のタイトジャンクションシ, 2017).

したがって、我々はナトリウムカプレートとのインキュベーションは、クラスター化されたclaudin-5発現X.laevis卵母細胞の接触面積の減少につながったと仮定した。 予想外に、ナトリウムカプレート（100と500μ m）の濃度の増加は、タイトな接合シールにナトリウムカプレートの保護効果を示すclaudin-5を発現するクラスタ化された卵母細胞の接触領域の増加につながった。 さらに、カプレートナトリウムは、アクトミオシン周囲機能環の収縮を誘導し、傍細胞空間を広げることが記載されている（Lindmark et al. ら、１ ９ ９ ８；Ｍａｈｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2009). この効果は、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸（PIP2）のイノシトール三リン酸（IP3）およびジアシルグリセロールへの切断につながるホスホリパーゼC, 1995). 足場タンパク質ZO-1によってアクチン細胞骨格に連結されたタイトジャンクション複合体は、タイトジャンクションから細胞質に再分配される(Lindmark et al. ら、１ ９ ９ ８年；Ｔｕｒｎｅｒ，２ ０ ０ ０年）。 Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞の細胞構築は、卵形成中の細胞質領域化のために極めて重要である（Ｗｙｌｉｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1985). しかし、受精の前に、TJP-1遺伝子発現は、ZO–1をコードする遺伝子は、卵母細胞の段階V-VIでのみ発現される（Session et al., 2016). したがって、細胞骨格足場とクローディンの減少した相互作用は、caprateインキュベーションの予期しない結果を説明するかもしれません。 この発見のメカニズム的基礎を検証するための将来の研究の範囲である。

しかし、傍細胞透過性に対するカプレートナトリウムの変異効果は、以前の文献に記載されていた。 成体ブタの腸から採取したＰｅｙｅｒパッチ組織においても同様の強化効果が検出された。 Claudin-5は5mM caprateとの孵化の後でかなり増加しました。 この研究では、ｃａｐｒａｔｅは、卵胞関連上皮において有意に高い経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をもたらした（Ｒａｄｌｏｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2019).

結論

結論として、xにおけるタイトジャンクションタンパク質claudin-5の異種発現。 laevis卵母細胞は、隣接する細胞の細胞間相互作用および癒着特性への単一クローディンの寄与に新しい洞察を可能にする。 したがって、claudin-5のx.laevisタイトジャンクションモデルを使用すると、単一セルモデル内のBBB成分の分析が可能になります。

データ利用可能性に関する声明

この研究のために生成されたデータセットは、対応する著者の要求に応じて利用可能です。

倫理声明

動物の治療は、ベルリン自由大学の動物福祉官の承認を得て、ベルリン獣医衛生検査官（landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin,permit G0025/16）の統治下で、ドイツの法律のガイ

著者の貢献

すべての著者が原稿を読み、承認しました。 NBとSAは実験を設計、計画、監督し、原稿を書いた。 ＮＢ，ＬＳ，ＶＣ，ＲＫ，ＰＦ-Ｂは実験とデータ解析を行った。

資金調達

この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft、Grant No.によって資金提供されました。 AM141/11-1とH.Wilhelm Schaumann Stiftung。

利益相反

著者らは、この研究は潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言しています。

謝辞

私たちは、優れた技術支援のためのMartin Grunau、Gisela Manz、Katharina Söllig、Susanne Trappeに感謝します。 我々は、ベルリン自由大学のオープンアクセス出版イニシアティブによる支持を認める。

補足資料

この記事の補足資料はオンラインで見つけることができます: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2020.00857/full#supplementary-material

図s1/クローディン-5の接触面積は、異なる濃度（n=6-8、それぞれ）と対照として水注入卵母細胞（n=5-7、それぞれ）のナトリウムカプレートとのインキュベーション中にμ m2で卵母細胞対を発現しています。