Acp1のEcClpPへの結合様式
ACP128によるClpP活性化の構造的基礎、NmClpPおよびEcClpPの構造を解明するために行われる。 1a)ACP1類似体との複合体が求められた。 結合したＡｃｐ１を有するＮｍｃｌｐｐの構造は、繰り返しの試みにもかかわらず達成されなかったが、Ｅｃｃｌｐｐ＋ＡＣＰ１−０ ６複合体の構造は、１.９Åの分解能に決定された（図 1b、c、表1)、非対称単位（鎖A-N）にテトラデカマーを含有する。 EcClpPの軸ループを形成するN末端残基の電子密度は、一つのサブユニット（鎖B）を除くすべてでは不明である。 以前に公開された構造では、これらの軸ループは非常に柔軟であり、通常、活性化剤の不在下で、または結晶包装によるprecclusionを介して結晶中で無秩序である23。 サブユニットDとEによって形成されたポケット内の単一のACP1-06分子について明確な電子密度が観察され、化合物の二つの異なる配置を示した（図。 2a、b）。 両方の配置は、電子密度でモデル化され、第一の配置は疎水性ポケット内に化合物のトリフルオロメチルピリジン部分を配置し（ダウン配置）、第二の配置は溶媒に曝された疎水性ポケットからそれを配置する（アップ配置）（図）。 2a）。 残りの13疎水性ポケットは、ACP1-06のあいまいな電子密度を示しています。 我々は、モデル化し、各リガンドのための改善された電子密度で、その結果、0.5の占有率で上下の両方の構成ですべての14ACP1-06分子を精製しました。
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ由来のＣｌｐｐの配列および構造。 Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍｃｌｐｐ）およびＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｃｃｌｐｐ）由来のＣｌｐｐの配列アラインメント。 Pro-sequenceは灰色の四角形にあります。 Ser-His-Asp触媒トライアドの残基は青色の長方形にあり、アスタリスクでマークされています。 Ｎｍｃｌｐｐ（Ｅ３ １、Ｅ５ ８）およびＥｃｃｌｐｐ（Ｅ４ ０、Ｅ６ ７、Ｙ７ ６）において変異した残基。 図4a、bは緑色の長方形で強調表示されています。 軸方向細孔付近の静電相互作用に関与する残基は、紫色の長方形（Ｎｍｃｌｐｐ中のＥ１ ３、Ｄ２ ３、Ｓ２ ６、Ｒ２ ７、およびＳ５ ７）で囲まれている。 Ｎｍｃｌｐｐ中の残基Ｓ５ ７は、Ｅｃｃｌｐｐ中のＡ６ ６に対応する。 スピン標識NMR研究で変異したNmClpPの残基T10およびI144は、黒い四角で囲まれています。 Ｎｍｃｌｐｐの二次構造を配列の上に示した。 bこの作業で使用される異なる化合物の化学構造。 CLPPのc結晶構造は、ACP1またはADEP結合時にグローバルな立体配座変化を示す。 ＡＣＰ１−０ ６（６ＮＢ１）、ａｐｏ−Ｎｍｃｌｐｐ（６ＮＡＱ）、およびＡＤＥＰ−１ ４（６ＮＡ Ｈ）を有するＮｍｃｌｐｐの本研究で決定された構造（アスタリスクおよび太字で示す）は、ａｐｏ−Ｅｃｃｌｐｐ（１ＹＧ６ １ ０）、ＡＤＥＰ１を有するＥｃｃｌｐｐ（３ＭＴ６ ４ ０）、およびＡＤＥＰ−０ ４（５ＤＫＰ；….. タンパク質は漫画表現であり、ACP1およびADEP化合物はスティックモデルである。 ＥｃｃｌｐｐおよびＮｍｃｌｐｐのａｐｏ構造は灰色に着色され、活性化剤結合構造は緑色（Ｅｃｃｌｐｐ）および紫色（Ｎｍｃｌｐｐ＋ＡＤＥＰ−１ ４／ＡＤＥＰ−０ ４）に着色されている。 軸ループ秩序は、それぞれEcClpPおよびNmClpPのADEP1またはADEP-04結合構造で観察されるが、これは結晶パッキングによるNmClpPのADEP-14結合構造では観察されない（補足図。 1d)
ClpPの疎水性ポケットにおけるACP1とADEPの結合モード。 1ºで輪郭を描か省略マップは、ACP1-06の上下の構成を示します。 水素結合および疎水性相互作用を介してACP1-06と相互作用するEcClpP残基を示すB二次元プロット。 ＡＣＰ１−０ ６およびＡＤＥＰ１の結合モードを示すＥｃｃｌｐｐの疎水性ポケットのｃ、ｄ表面表現。 蛋白質の表面は青の肯定的および赤の否定的の静電気の潜在性に従って着色されます。 ACP1-06はマゼンタとピンクで、adep1はシアンで示されています。 (D)では、結合ポケットのカットビューは、ADEP1のフェニルアラニン部分とACP1-06のトリフルオロメチルピリジン基をダウン構成で収容する疎水性ポケットを強調して表示されている。 結合したＡＤＥＰ−０ ４およびＡＤＥＰを有するＮｍｃｌｐｐ疎水性ポケットのＥ、ｆ表面表現-14
ＡＣＰ１−０ ６の結合モード（図１）。 2b–d)異なる細菌ClpPsの結晶構造で観察されたADEPsのものを近似する(図2b-d)。 2c-f）6,15,18,19,21,40。 なお、当グループで合成された化合物はACP1-YYおよびADEP-YYと番号が付けられており、他のグループの研究からの化合物はそれぞれ発表された論文のように Ａｃｐ１−０ ６との全てのタンパク質接触は、（１）Ｙ７ ６のフェノール性ヒドロキシル側鎖とＡＣＰ１−０ ６のアミド酸素と、（２）ｒ２ ０ ６のグアニジニル側鎖（Ｅｃｃｌｐｐ中の最後から二番目のＡｒｇ）とａｃｐ１−０ ６のスルホニル酸素との間に生じる２つの注目すべき静電結合を除いて、本質的に非極性である（図１）。 2b）。 後者の二つの相互作用は、ACP1-06の両方の構成に存在する。 さらに、Ｒ２ ０ ６（鎖Ｅ）は、隣接するサブユニット（鎖Ｄ）のＥ６ ５とのイオン結合によって安定化される（図３）。 3a、b）。
ClpPにおける活性化剤結合部位のビューをクローズアップ。 a-c apo-EcClpP、EcClpP+ACP1-06、およびEcClpP+ADEP1の2つのサブユニット間のインターフェイス。 d-f apo-NmClpP、NmClpP+ADEP-14、およびNmClpP+ADEP-04の2つのサブユニット間のインターフェイス。 すべてのパネルで、テキストで議論されている残基間の距離は破線で示されています。 距離が≤4の場合。3Åの場合、破線は黒であり、それ以外の場合は破線は赤である。 4.3Åは、e67(D)とR36(E)の側鎖間のapo-EcClpP(1YG6)で観察される距離である（図。 3a)
ダウン配置では、ＡＣＰ１−０ ６のトリフルオロメチルピリジン部分は、Ｌ６ ２、Ｔ９ ３、およびＦ９ ６（鎖Ｄ）、ならびにＹ７ ４、Ｙ７ ６、Ｉ１ ０ ４、Ｌ２ ０ ３、およびＬ１ ２ ８（鎖Ｅ）によって形成さ および３ｂ）。 これは、我々のＮｍｃｌｐｐ＋ＡＤＥＰ−０ ４ １ ９（図１）のように、Ｃｌｐｐで共結晶化された異なるＡＤＥＰ類似体の環式外Ｐｈｅ残基の環によって占められているのと同じ空洞である。 またはＥｃｃｌｐｐ＋ＡＤＥＰ１構造４ ０（図２Ｅ、ｆ）。 2c、d）。 対照的に、ｕｐ配置では、トリフルオロメチルピリジン部分は、Ｃ−Ｓ結合の周りに回転され、ｖａｎ ｄｅｒ ＷａａｌｓがＹ７ ４、Ｉ１ ０ ４、Ｆ１ ２ ６、およびＬ２ ０ ３（鎖Ｅ）と接触する間に溶媒が露出 および３ｂ）。 Gem-ジメチル部分はY74の平らな環（鎖E）に対してスタックし、拡張された脂肪族鎖はオルト-クロロ置換フェニル環で終端し、隣接するサブユニットからの二つのヘリックスの間の非極性溝に座っている（図。 3b）。 この結合裂は、Ｌ６ ２（鎖Ｄ）、Ｆ６ ３（鎖Ｄ）、Ａ６ ６（鎖Ｄ）、Ｌ３ ７（鎖Ｅ）、Ｖ４ ２（鎖Ｅ）、およびＥ４ ０（鎖Ｅ）の非極性部分によって形成される（図１および図２）。 および３ｂ）。
EcClpPのACP1-06結合構造とADEP1結合構造の両方で、R36とE40の間のサブユニット内塩橋が見出され、ADEP1の近くの脂肪族尾部またはACP1-06のクロロ置換フェニル環がe40の側鎖と疎水性相互作用を形成する（図。 3b、c）。 二つの活性化剤は二つの異なる水素結合パターンによって疎水性サイトでさらに安定化される。 ＡＣＰ１−０ ６は、そのスルホニル基とＣ末端Ｒ２ ０ ６残基との間の溶媒に曝されたイオン相互作用を介して固定されるが（図３）、ＡＣＰ１−０ ６は、そのスルホニル基とＣ末端Ｒ２ ０ ６残 図3b)に示すように、ADEP1は、疎水性部位内に隔離されたY76の水酸基との二つの水素結合によって所定の位置に保持される(図3b)。 3c）。 Ｅ６ ５とＡＤＥＰ１のｎ−アシルＰｈｅ側鎖のカルボニル基との間の溶媒媒介水素結合は、Ｅｃｃｌｐｐとの相互作用をさらに強化する（図２）。 3c）。 この余分な水素結合だけでなく、ACP1の小さなトリフルオロメチルピリジン基に比べてファンデルワールス相互作用を形成するためのより多くの表面積を有する環状デプシペプチド環の大きなサイズは、Acp1S28よりもADEPsのために観察された一般的にタイトな結合を説明するかもしれません。
EcClpP+ACP1-06構造では、触媒トライアドの求核残基S111から延びるすべての14サブユニットに原因不明の電子密度を発見し、共有結合修飾を示唆している（補 1a、b）。 密度は、S111側鎖から離れた反対方向にほぼ直角に延びている。 広範な努力にもかかわらず、それは説得力のあるペプチド、アシルケトン製品や様々な既知のセリンプロテアーゼ阻害剤分子を装着することがで＜２ ９ ３ ５＞＜１ ４ ２ ５＞ＡＤＥＰのＮｍｃｌｐｐへの結合様式＜２ ８ ６ ０＞＜４ ３ ３ ５＞Ｎｍｃｌｐｐは、Ｅｃｃｌｐｐと比較してＣ末端に４つの余分な残基を有する一方で、Ｎ末端に短いプロ配列を有する（図３）。 1a）。 NmClpPは、N末端His6タグを運ぶ全長タンパク質として発現したが、我々は繰り返しNi-ニトリロ三酢酸樹脂への結合の欠如を観察した。 精製されたタンパク質のｎ末端配列決定は、成熟Ｎｍｃｌｐｐが残基Ｙ６で開始することを明らかにした（図１ ０Ａ）。 1a)、そのN末端プロ配列(1MSFDN5)を解放するために自己タンパク質分解を示す。
以前は、ADEP-0419でNmClpPの構造を決定していました。 本研究では、2.0Åにapo-NmClpPと2.7Åに結合したADEP-14とNmClpPの構造を決定した（図。 図1b、c、補足図。 1c、表1）。 Apo-NmClpPの構造は非対称的な単位でtetradecamerを含み、14のN末端の軸ループの何れかのための明確な密度を示さない。 ハンドル領域のストランドβ8の残基G133-G137によって形成されるループについては、弱い電子密度が観察される（図。 1a）。 NmClpP+ADEP-14結晶の非対称ユニットは、二つのテトラデカマーを含む（補足図。 1d）。 結晶パッキングのために、すべての28サブユニットの残基1-22について電子密度は観察されなかった（図。 図1c、補足図。 1d）。 さらに、β8鎖（残基130-137;図。 1a)は、すべてのサブユニットで部分的にのみ可視である。 ＡＤＥＰ−１ ４は、ＡＤＥＰ−０ ４と同様の構成でＮｍｃｌｐｐに結合する。 ２ｅ，ｆおよび３ｅ，ｆ）。 手短に言えば、ＡＤＥＰ−１ ４のジフルオロフェニル部分は、１つのサブユニットのＹ６ ７、Ｌ９ ５、Ｌ９ ７、およびＬ１ １ ９、ならびに隣接するサブユニットのＶ４ ９、Ｌ５ ３、Ｔ８ ４、およ 3e）。 ピペコール酸部分の六員環は溶媒に曝され、Ｆ１ １ ７のフェニル環およびＬ９ ７、Ｌ１ １ ９、およびＬ１ ９ ６の疎水性側鎖によって安定化される（図３）。 3e）。 デプシペプチド環のアロ-スレオニン残基上の付加的なメチル置換（Fig. 1b)溶媒が露出している。 ADEP-04と同様に、ADEP-14は、Y67のフェノール性ヒドロキシル基、ジフルオロフェニルアラニン残基のアミノ基、デプシペプチド環のアラニンカルボニル基と、e56との溶媒媒介水素結合との二つの水素結合相互作用によって、高度に相補的な疎水性ポケットに固定されている（図。 3e、f）。 ＡＤＥＰ−１ ４のオクタジエン酸側鎖は、１つのサブユニットのＬ５ ３、Ｆ５ ４、およびＳ５ ７、ならびに隣接するサブユニットのＲ２ ７、Ｌ２ ８、Ｅ３ １、Ｉ３ ３、Ｆ３ ５、およびＹ６ ７によ 3e）。
ACP1-およびADEP-結合は、EcClpPおよびNmClpPのapoおよび化合物結合形態の構造を用いて、ClpPバレル
に対して明確なアロステリック効果をもたらす（図。 1c)、我々は活性化剤結合時に起こるアロステリック効果をプローブした。 図に示すように。 2つの隣接するサブユニットの横方向の変位を引き起こすくさびとして活性化剤の結合が機能します。 ＡＣＰ１−０ ６結合（ａｐｏ−Ｅｃｃｌｐｐに対するｒｍｓｄ＝０．73Åのapo-NmClpPに対して)、しかしADEP-14のそれよりより少し(apo-NmClpPに対してrmsd=2.47Å)。 興味深いことに、変位の方向は、活性化剤の二つのクラスの間で異なっている（補足図。 2および補足映画1-4）。 二つのAdepの間で、ADEP-14はNmClpPシリンダーに大きな全体的な構造摂動を引き起こします（補足映画3対4を比較してください）。 ＡＤＥＰ結合は，赤道領域での狭窄を伴うＮｍｃｌｐｐの頂端表面の拡張をもたらす。 この運動のためのピボットは、ヘリックスaEとストランドβ8で構成されるハンドル領域にあります。 この現象は、これまでに知られているすべてのADEP結合ClpP構造で観察され、ClpPシリンダーの圧縮の程度は様々である15、18、19、23、40。 対照的に、EcClpPに結合するACP1-06は、すべてのサブユニットの内向きの動きを引き起こし、ClpPシリンダーの締め付けをもたらす（補足ムービー1）。 したがって、構造は、Acp1SとADEPsが明確なアロステリック効果を誘導することによってClpPを活性化することを示しています。
活性化剤結合EcClpPとNmClpP構造では、テトラデカマーを安定化する環-環界面静電結合は、配座の変化にもかかわらず保存されたままである（補足図。 3). さらに、活性化剤結合時の全体的な構造変化にもかかわらず、EcClpPおよびNmClpPのSer-His-Asp触媒トライアドは、活性部位の近くでマイナーなCa骨格シフトのみが起 1a-c–。 Ｃｌｐｐのすべての既存のＡＣＰ１結合構造およびＡＤＥＰ結合構造の分析は、化合物結合が赤道領域の収縮をももたらすことを示している（補足図４）。 4).
各触媒室の体積を測定することにより、ACP1またはADEP結合時のClpPシリンダーの圧縮を定量化しました（補足図。 4). ACP1-06結合は、apo-EcClpPに対する触媒チャンバ容積の-5％の減少を引き起こす。 EcClpPへのADEP1結合は触媒作用の部屋の容積の同じような減少で起因します。 これは、ＡＤＥＰ−１ ４結合Ｎｍｃｌｐｐ、ＡＤＥＰ−結合Ｂｓｃｌｐｐ、およびＡＤＥＰ−結合Ｍｔｃｌｐｐ１Ｐ２ヘテロオリゴマー複合体のような他の活性化因子結合Ｃｌｐｐ構造についても観察される（補足図４）。 4).
ClpP活性化は、軸細孔における静電結合ネットワークの再編成をもたらす
apo-NmClpPの構造において、軸細孔の近くの二つの静電結合は、隣接する二つのサブユニットの界面を安定させる。 3d、補足図。 5). まず、一つのサブユニットの負に荷電したE58カルボキシレート基は、隣接するサブユニットの正に荷電したR27グアニジニウム基とイオン対を形成する。 第二に、隣接する二つのサブユニットのS57ヒドロキシル基とE31カルボキシレート基は水素結合を形成する。 ADEPが結合すると、これらの2つの非共有結合が切断され、同じサブユニットのR27とE31との間のイオン結合が短縮される、すなわち強化される（図 3e、f）。 Apo-EcClpPでは、NmClpPのS57と同等の残基がEcClpP中のアラニンであり、したがってE40と水素結合を形成することができないため、E67とR36の間の一つのイオン結合のみが二つの隣接するサブユニットを連結する。 3a）。 Ｎｍｃｌｐｐと同様に、Ａｃｐ１またはＡＤＥＰ１のＥｃｃｌｐｐへの結合は、サブユニット間Ｅ６ ７−Ｒ３ ６イオン結合を除去し、Ｒ３ ６とＥ４ ０との間のより強いサブユニット内イオン結合を 図３Ｂ、ｃ、補足図３Ｂ、Ｃ、補足図３Ｂ。 5).
これらの観察をさらに検証するために、我々は上記のサブユニット間静電結合の損失につながるNmClpPとEcClpP点変異体を設計しました。 図に示すように。 図４Ａに示すように、ＷＴ Ｎｍｃｌｐｐはタンパク質カゼインを分解することができなかったが、Ｎｍｃｌｐｐ Ｅ５ ８Ａ変異体は、Ｅ３ １Ａ変異体よりも高い速度でカゼインを分解 重要なことに、二重変異体E31A+E58Aは、単一変異体よりもさらに高い活性を有していた。 二重変異体Ｎｍｃｌｐｐの活性化の程度は、１μ Ｍ Ａｄｅｐｓまたは１ ０μ Ｍ Ａｃｐ１Ｓの存在下で観察されたものと類似している（図１）。 4a）。 同様の変異を有するＥｃｃｌｐｐについて同様の挙動が観察された（Ｅ４ ０ＡおよびＥ６ ７Ａ；図２Ｂ）。 4b）。 それぞれのＥｃｃｌｐｐ二重変異体は可溶性ではなく、試験することができなかった。
NmClpPおよびEcClpPにおける突然変異の活性化。 モデル基質としてカゼイン-FITCを用いた変異体EcClpPおよびNmClpPのタンパク質分解活性の化合物活性化ClpPとの比較。 化合物の構造を図１に示す。 1b.すべての実験を3回行った。 ソースデータは補足データ1で利用可能です。 C NmClpP E58a変異体における二つのサブユニット間のインターフェイス。 D NmClpP E31A+E58a変異体における二つのサブユニット間のインターフェイス
続いて、本発明者らは、Ｎｍｃｌｐｐ Ｅ５ ８ＡおよびＮｍｃｌｐｐ Ｅ３ １Ａ＋Ｅ５ ８Ａ変異体のＸ線構造を決定した（表１）。 両方の変異体中の触媒部位は摂動されない（補足図１ ０Ａ）。 1e）。 NmClpP E58A単一変異体では、変異はサブユニット間E58–R27イオン結合を廃止し、より強いサブユニット内R27–E31相互作用を生じさせ、S57とE31の間の水素結合は残っている（図。 4c）。 このように、NmClpP変異体のCa骨格の微妙な大域的立体配座変化（wt NmClpPに対してrmsd=0.33Å）によって示されるように、同様の「くさび効果」が構造において観察され 二重変異体NmClpP E31A+E58Aを生成するためのアラニンへのE31およびE58の両方の変異（wt NmClpPに対してrmsd=0.29Å）は、NmClpP E58A単一変異体中に存在する2つの安定化サブユニット間静電相互作用、ならびにサブユニット内R27–E31イオン結合を廃止する（図10B）。 4d,補映画6）ADEPバNmClpP。 3e、f）。 このように、NmClpP E31A+E58A二重変異体は、除去されたサブユニット内イオン結合を有するADEP結合NmClpPとは異なり、それにもかかわらず、小分子活性化ClpPのそれに匹敵する固有のタンパク質分解活性を有する活性化されたタンパク質である（図10B）。 4a）。 ＡＤＥＰ結合Ｎｍｃｌｐｐのように、ｎｍｃｌｐｐ単一変異体および二重変異体の両方は、Ｃｌｐｐバレル圧縮のために触媒チャンバ容積が減少している（補足図１）。 4).
このような結合ネットワークの再編成は、小分子活性化剤の存在下であろうと、特定の変異によるものであろうと、PDBで利用可能なすべての活性化ClpP構造 6). 例えば、ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｃｌｐｐ（Ｂｓｃｌｐｐ）、ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃｌｐｐ（Ｓａｃｌｐｐ）、ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｃｌｐｐ（Ｍｔｃｌｐｐ）、およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃｌｐｐ（Ｈｓｃｌｐｐ）に結合する小分子活性化剤は、軸細孔付近の１つまたは２つのサブユニット間静電結合を廃止し、より強いサブユニット内イオン相互作用を生じさせる（補足図１）。 6a-e、g-l）6,15,18,21,39。 Mtclpp2では、NmClpPにおけるE58–R27相互作用に相当するサブユニット間イオン結合は存在しない18。 Ｎｍｃｌｐｐのｅ５ ８の等価残基は、Ｍｔｃｌｐｐ２中のＬ６ ６であり、Ｍｔｃｌｐｐ２のＫ３ ５（ＮｍｃｌｐｐのＲ２ ７に相当）とのイオン相互作用に関与することができない。 代わりに、S65とE39の間のサブユニット間水素結合は、界面を安定化させる（補足図。 6g、h）。 Mtclpp2に結合するADEPは、S65–E39水素結合を破壊し、K35とE3918の間のサブユニット内イオン結合を強化する。
興味深いことに、活性化されたSaClpP Y63A variant41でさえ、疎水性部位の中心に活性化変異が見られ、したがって、ここで提示されたNmClpPの活性化変異と同等ではない、ClpP活性化時の軸細孔周りの水素結合ネットワークの再編成の提案されたモデルを支持している（補足図。 6階）。 SaClpP Y63a変異体の構造では、サブユニット間イオン対（Q54–R23）間の距離が増加し、サブユニット内塩橋（R23–D27）が強化される（補足図。 6d、f）。 我々はまた、EcClpPとNmClpPの両方で同等のY63A変異を生成しました。 Ｎｍｃｌｐｐ ｙ６ ７Ａ変異体は不溶性であったが、Ｅｃｃｌｐｐ Ｙ７ ６Ａは、Ｅ４ ０Ａ変異体よりわずかに高い活性を有したが、Ｅ６ ７Ａ変異体よりも低い活性を有した（図１Ｂ）。 4b）。
ClpP活性化は、N末端軸ループの構造不均一性を減少させる
上記のように、Β1-β2ヘアピンターンを形成するNmClpP+ADEP-04複合体の順序付けられた軸ループでは、ADEP結合はE58とのサブユニット間イオン結合からR27を放出し、ヘリックスaAのE31とのサブユニット内イオン結合を強化する（図。 5a）。 その結果、R27は軸ループの鎖β1のD23とイオン結合を形成する。 この安定化相互作用は、軸ループが秩序化されているClpPのすべての活性化剤結合構造において観察される（図。 5a-e）。
活性化されたＣｌｐｐにおけるＮ末端軸ループの順序付け。 A-g ClpP活性化化合物複合体における軸方向ループ秩序を促進する関連する相互作用が強調表示されています
EcClpP+ACP1–06構造の場合、軸ループ（残基14-31）は、β1-β2ヘアピンターンを形成する1つの軸ループのうち1つのみで結晶中に部分的に秩序づけられている（図。 1c—完全な順序は、結晶充填効果によって部分的に防止されるようである）。 サブユニットAの順序付けられた軸方向ループでは、E67とのサブユニット間イオン結合からR36が放出されると、ヘリックスaAのE40とのより強いサブユニット内イオン結合を形成することができる（図。 5階）。 しかしながら、鎖β１のＥ２ ２とらせんＡ ＡのＲ３ ６との間には安定化イオン相互作用は存在せず、おそらく部分的な秩序化に起因する（図１ ０Ａ）。 5階）。 鎖β２のＤ３ ２とらせんＡ ＡのＳ２ １との間の付加的な水素結合は、軸方向ループをＥｃｃｌｐｐコアドメインに固定する（図１ ０Ａ）。 5階）。 同様に、Enterococcus faecium ClpP(EfClpP)-ADEP4構造の軸ループは部分的にのみ順序付けられている21。 らせんaAのArg残基と鎖β1の負に荷電した残基との間の保存された水素結合は、部分的に秩序化されたEfClpP軸ループでは見られないが、EfClpPは鎖β1（T6）上および鎖β1とβ2（E9、Q10、S11、S12、E15）上の残基を形成する可能性のある水素結合を有するが、鎖β1とβ2（E9、Q10、S11、S12、E15）上に見られる。 5g）。
保存された静電相互作用に加えて、ClpPヘッドドメインとの広範な疎水性接触は、軸ループを安定化させる。 EcClpP+ACP1-06では、鎖β1の非極性N末端残基と先行する構造化コイルは、同じサブユニットのヘリックスaAの非極性残基との疎水性相互作用に関与し、隣接するサブユニットのヘリックスaA’およびaB’の疎水性面上にある（補足図）。 7a）。 ヘリックスＡ Ａ、Ａ Ｂ’、およびβ３’上の非極性残基は、軸方向細孔の円周上の連続的な疎水性パッチを構成する（補足図３）。 7b)15.
ClpP軸ループの立体配座不均一性をより明確に把握するために、メチル-トロシー NMR実験を行った。 最初に、単一のシステインの突然変異はNmClpP（T10C）の軸ループで導入されました。 均一に重水素化されたタンパク質が生成され、続いて13C-メチルメタンチオスルホン酸（MMTS）と反応した。 これにより、単一のNMR可視13CH3–S基がシステイン側鎖に結合し、S-メチルチオ-システイン（MTC）残基が形成される42。 この方法は、溶液中の大きな複合体の構造とダイナミクスを監視する簡単な方法を提供します。 酵素の自由な、活性化剤結合されたか、または変異させた形態の付けられた回転の調査のNMR相関を監視することは軸気孔の解決の立体配座の読み出
最初に、T10MTC部分の導入がNmClpPの構造を撹乱しないことを確実にするために対照実験を行った。 簡単に説明すると、WTとt10MTC NmClpPの1H–13C異核多重量子コヒーレンス（HMQC）相関は、そうでなければ完全に重水素化された背景にILVM残基の側鎖で13CH3をラベ 続いて、異なる状態でＮｍｃｌｐｐ Ｔ１ ０ＭＴＣの１Ｈ−１ ３Ｃ ｈｍｑｃ相関が得られた（図３）。 6a）。 アポ形（青い輪郭）は、構造的に不均一な軸ループを示す多数の相関を有する。 ２倍モル過剰のＡＤＥＰ−２ ８の添加（図１ ０Ａに示される活性）。 4a)単量体ClpP上では、剛性化または構造秩序化を示す相関の数（赤い輪郭）が有意に減少した。 一方、ACP1-17結合(二大臼歯の過酵ClpP行されます。 4a)は、観察された相関（緑色の輪郭）の検出不可能な変化をもたらし、軸方向ループは影響を受けないことを意味する。
NMRによるNmClpPダイナミクスとSAXSによるプロテアーゼ溶液構造の解析。 軸ループ（位置10）およびハンドルの螺旋形（位置144）の単一の13CH3調査を作り出すためにMMTSと分類されるNmClpPの1H–13C HMQCスペクトル。 スペクトルは、活性化突然変異を有する構築物のためだけでなく、apo-、ADEP-28-およびACP1-17結合形態で記録された。 NmClpPプロトマー濃度は200-250μ mの範囲であった。 化合物はプロトマー濃度よりも二倍モル過剰であった。 ＡＤＥＰ−０ ４の非存在下（黒）および存在下（青）におけるＮｍｃｌｐｐのＢ散乱曲線。 記号は実験データを表し、実線はGNOM曲線の近似を表します。 比較のために、Ｎｍｃｌｐｐ＋ＡＤＥＰ−０ ４曲線の値を１ ０で割った。 GNOMソフトウェアによって決定されるNmClpPのcペア距離分布関数p(r)。 Apo NmClpPは黒で表示され、NmClpP-ADEP-04は青で表示されます。 apo-NmClpPおよびNmClpP+ADEP-04のd、e最も可能性の高いダミー原子モデル（ダム）は、灰色のドットとして示されています。 実験データへのダム散乱プロファイルのフィッティングは、補足図に示されています。 ＡＰＯ−Ｎｍｃｌｐｐ（黒）およびＮｍｃｌｐｐ＋ＡＤＥＰ−０ ４（青）の結晶構造を、ＳＵＰＣＯＭＢプログラム６ ５を用いてダム上に重ね合わせた。 各モデルの横には、10個の独立したダンミンランに基づいて平均軸方向の高さのダムが表示されています。 スケールバーは下部に表示されます。 DAMMINプログラム62によって生成されたすべてのモデルの平均から導出されたf、gダム確率マップ（灰色のドット）（apo-NmClpPの場合は0.745±0.033、ADEP-04結合NmClpPの場合は0.708±0.027の平均正規化された空間不一致、NSD）。; ０に近い値は、理想的に重畳された構造を示し、１より高い値から有意に異なる値を示す）および最も高いＤａｓ占有率の領域が、ａｐｏ−Ｎｍｃｌｐｐ（黒）およびＡＤＥＰ−０ ４結合Ｎｍｃｌｐｐ（青）につ 平均確率マップと最高Ｄ ａ占有マップの両方の高さを与えた。 最高のＤ ａ占有マップに対する軸方向細孔の円周も与えた。 3D構造とダムは、UCSFキメラソフトウェアを使用してレンダリングされました(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)
このアプローチはまた、突然変異を活性化する効果をモニターするために利用された（図１ ０Ａ）。 軸方向ループ上の図４Ａ、ｂ）。 これらの実験では、活性化突然変異は、Ｔ１ ０Ｃ（標識）突然変異の背景に導入された。 図に示すように。 図６Ａに示すように、Ｎｍｃｌｐｐ Ｔ１ ０ＭＴＣ／Ｅ３ １ａ変異体（赤色の等高線）の相関は、擬似Ｗ Ｔ形態よりもわずかに不均一であるが、Ｎｍｃｌｐｐ Ｔ１ ０ＭＴＣ／Ｅ５ ８Ａ変異体（橙色の等高線）の 両方の活性化変異（NmClpP T10MTC/E31A+E58A）の同時存在は、単一の変異よりもはるかに劇的な効果を有し、軸ループ（黒い輪郭）に対応する多数の相関を除去する。 これは、二重変異体が単一変異体よりも活性であるという観察と一致している（図１ ０Ａ）。 4a）。
ClpPの活性化は、ハンドル領域の立体構造の不均一性の減少をもたらす
同じNMRベースのアプローチを使用して、ハンドル領域に対する活性化剤の結合およ NmClpPのI144MTC（ヘリックスaE）変異体を調製し、APO-、ADEP-28-、およびACP1-17結合型のNMRによって研究した。 Apo形（青い輪郭、Fig. 6a)は、Ecclpp4に関する我々の以前の研究に見られるように、ハンドル領域が共存する立体配座のペアに関連付けられていることを示す、一対のピークを表 興味深いことに、ACP1とADEPの添加は、ピークの一つの消失につながります。 活性化剤結合部位がNMRスピンプローブの遠位であることを考えると、ACP1またはADEP結合アロステリックハンドル領域の立体配座のいずれかを選択す あるいは、活性化剤は、両方の形態を結合するが、単一の状態への変化を誘導することができるかもしれない。
の混合遅延周期を用いた磁化交換実験100, 200, 300, 400, 500, そして600ms40°CでWT NmClpPのハンドル領域で観察されたコンホーマ間の相互変換を検出することができませんでした。 これは、交換プロセスがNMRによる特性評価には遅すぎることを示しています。
SAXSは、溶液中の活性化剤誘発性ClpP立体配座変化を示しています
さらにオリゴマー状態と化合物の結合時の構造変化をプローブするために、apo-NmClpPとNmClpP+ADEP-04 図６ｂ−ｇおよび補足図６Ｂ−ｇおよび補足図６Ｂ−ｇ 8). 最終的なマージされた曲線は、図に示されています。 6b、および得られたSAXSプロファイルは中空構造のものと類似していた43。 全体的な折り畳みの点で有意な変化は見られなかった（補足図。 ＮｍｃｌｐｐにＡＤＥＰ−０ ４を添加したときの回転半径（Ｒｇ）およびオリゴマー状態（補足図８）。 8c）。 Ｎｍｃｌｐｐｓａｘｓプロファイルをさらに解析し，解ａｂｉｎｉｔｉｏ構造を生成するために，ｇｎｏｍプログラムを用いて対距離分布関数ｐ（ｒ）を構築した。 Ａｐｏ−Ｎｍｃｌｐｐ ｐ（ｒ）は、ＡＤＥＰ−０ ４結合Ｎｍｃｌｐｐと比較して微妙な右シフトおよびより大きな最大寸法（Ｄｍａｘ）を明らかにした（図１）。 図６ｃおよび補足図６ｃおよび補足図６ｃ。 8c）。 続いて、ＳＡＸＳデータを使用してダミー原子モデル（Ｄａｍ）を生成し、Ｎｍｃｌｐｐ溶液構造を視覚的に解析した（図１）。 6d-g）。 Apo-NmClpPとADEP-04結合NmClpPのためにテンモデルが生成され、最も可能性の高いものが選択されました。 これらのモデルは，全体として，二つのＮｍｃｌｐｐ解構造が類似していることを示した（中空円筒）。 しかし、対応する結晶構造と重畳すると、高分解能構造と一致する違いが容易に観察された（図2）。 6d、e）。 ApoおよびADEP-04結合NmClpPのすべてのダムの軸方向の高さの測定は、apo型では93.0±5.4Å、ADEP-04結合型では103.5±6.1Åの値をもたらした。 この観察をさらに確証するために、平均ダム確率マップおよび最高DAs占有率マップ（図１）を用いた。 ６ｆ、ｇ）を分析した。 軸方向の高さは、apo-NmClpPと比較してADEP-04結合NmClpPの約10Åの増加を示した。 さらに、ＡＤＥＰ−０ ４結合Ｎｍｃｌｐｐは、ａｐｏ−Ｎｍｃｌｐｐよりも大きな軸方向細孔周囲を示した（図１）。 6f,g)。 したがって、SAXS技術の低分解能にもかかわらず、結果は、NMCLPPへのADEP-04結合はNmClpPのオリゴマー状態に影響を与えないが、軸細孔の拡張とNmClpP+ADEP-04DAMの上部と下部での占有率の増加を引き起こすことを示唆している（図。 Ａｐｏ−Ｎｍｃｌｐｐと比較した。 これは，ｘ線およびＮＭＲによって観察されたＮｍｃｌｐｐのｎ末端軸ループの構造の不均一性の減少につながる配座変化を反映している可能性が高い。