プラスミドと株の構築
chp1Cd変異体を発現および精製するために、Pet28aから始まる補足表S2に記載されているプライマーを用いて逆PCRによって生成した。chp1クロモドメインプラスミド。 ヘテロクロマチンレスキューアッセイは、chp1δ株（SP170、補足表S3を参照）でその内因性プロモーターの下でchp1wtとchp1変異タンパク質を含むプラスミドの chp1全長遺伝子とその内因性プロモーター（-949bp chp1+コード配列の開始から）prep1プラスミドでクローニングされました。 chp1クロモドメイン変異体は、補足表S2に記載されているプライマーを使用して逆PCRによって生成され、示されたchp1δ株で形質転換された。
ゲノム統合のために、prep1プラスミドは、次の統合カセットとnmt1+プロモーターを置き換えるために変更されました：Chp1遺伝子（染色体I、2215500—2215055）（AscI）-Hphmx6耐性カセット—（SphI）Chp1内因性プロモーター（染色体I、2214829—2214664）-Chp1コード配列-（BamHI）Ｃ ＨＰ１ターミネーター（染色体Ｉ、２ ２ １ ０ ９ ７ ６−２ ２ １ ０ ５ ８ ２）（ｂａｍｈｉ）。 次いで、統合カセット（ｃｈｐ１＋およびＣＨＰ１ＬＯＯＰ１Ｂ／２Ｂカセットの両方）をＰＣＲ増幅し、電気穿孔法によってＳＰ１ ０ １、ＳＰ１ ７ ０およびＳＰ６ ４株に形質転換した。 次いで、細胞をＹＥＳ＋Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（５ ０ｍｇ ｍｌ−１Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）プレート上で選択した。 単一のコロニーを単離し、PCRスクリーニングし、Hphmx6抵抗カセットとLOOP1B/2B変異のゲノム挿入のために配列決定した。プラスミドを含む
株をEdinburgh Minimal Medium Complete(EMMC)-leu培地上で増殖させた。 本研究で使用されるすべての株およびプラスミドは、補足表S3およびS4に記載されている。
タンパク質精製
His6-SUMO-Chp1CdおよびすべてのCD変異体はEで発現した。 ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。 His6-SUMO-Chp1Cdは、二つのタグの間にトロンビン切断部位を含む。細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（20mM4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)pH7.5、150mM NaCl、1mM dithiothreitol(DTT)、20mMイミダゾール）中に再懸濁した。 フラッシュ凍結後、細胞を解凍し、超音波処理の前にリゾチーム中で３ ０分間インキュベートした（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２ ５ ０−ｏｕｔｐｕｔ４、ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ４ ０）。 懸濁液を遠心分離し（12000g、4℃で20分）、上清を結合緩衝液（20mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、1mM DTT、20mMイミダゾール）中で予め平衡化したNi-NTA樹脂に加え、回転下で4℃で30分 次いで、樹脂を結合緩衝液で５回洗浄し、タンパク質を溶出緩衝液（２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７． 次いで、CHP1CD wtおよび変異体を、20mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、1mM DTTを含む緩衝液中でo/Nで染色した。 次いで、ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−Ｃｈｐ１Ｃｄを、ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７ ５ｐｇ；ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製し、２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．
サイレンシングアッセイ
サイレンシングアッセイのための細胞をOD0.7–1まで増殖させ、その後、培養物の1×107細胞ml−1の最終濃度に正規化した。 最高密度スポットが1×105個の細胞を含むように、10倍の連続希釈を行った。 細胞は、非選択的（はい）および5-フルオロ-オロチン酸（5-FOA1g l-1 5−FOA）プレート上に斑点を付けた。 プレートを32℃で2-3日間インキュベートし、撮像した。 細胞は、中心周囲imrリピート（ヘテロクロマティック遺伝子座）に挿入されたura4レポーター遺伝子を持っています。 Ｕｒａ４レポーター遺伝子がサイレンシングされると、細胞は５−ＦＯＡ含有培地上で増殖することができる。 ヘテロクロマチンが失われると、ura4レポーター遺伝子が発現し、細胞は5-FOA培地上で増殖することができない。
QPCR(RT-qPCR)によるRNAレベルの検出
酵母培養物(10ml)をOD600の0.7–1.5まで増殖させた。 次いで、細胞を溶解緩衝液500μ l(300mM NaOAc pH5.2、1%ドデシル硫酸ナトリウム)およびフェノール–クロロホルム500μ l中に再懸濁し、65℃で10分間一定混合した。 水性画分を遠心分離（１ ０分、２ ０ ０ ０ ０ｇ）によりフェノール−クロロホルムから分離し、エタノールを沈殿させた。 核酸を、Ｄｎａｓｅ ｉ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３ ７℃で３ ０分間処理し、続いて７ ５℃で１ ５分間熱不活性化した。 標準条件を使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１ ０ ０ｎｇのＲＮＡおよび１ｐｍｏｌのＤＮＡオリゴを使用して相補的ＤＮＡを合成した。 ＲＮＡレベルを、Ｂｉｏｚｙｍ Ｄｙｎａｍｏ Ｆｌａｓｈ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔを使用してｑＰＣＲで定量し、真色性遺伝子ｔｄｈ１に対して正規化した。
RNA電気泳動移動度シフトアッセイ
RNAシフトアッセイは、以前に報告された条件に従って実行されました。 合計で、0。66pmol32P放射性標識30nt動原体RNAの10μ m Chp1クロモドメイン(野生型および変異体)20mMトリスHCl pH7.5、100mM KCl、0.5mM DTTおよび3%グリセロールを含むバッファー 100nt dg動原体転写物とRNA EMSAのために、2pmolの32P放射性標識RNAのインキュベートした0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) １ ５μ ｌの最終体積中のＣｈｐ１Ｃｄタンパク質（ｗ ＴおよびＬＯＯＰ１Ｂ／２Ｂ変異体）のｐｍｏｌｓ。 Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３ペプチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１：１のＣｈｐ１Ｃｄ−Ｈ３Ｋ９Ｍｅペプチドで添加した。 インキュベーションを氷上で１時間実施し、次いで試料（最終体積２ ０μ ｌ）を１ ０％アクリルアミド−ＴＢＥ天然ゲル（ビス−アクリルアミド比１：２ ９）上に負荷した。 インビトロＲＮＡプルダウンのために、１μ ｇのＳＵＭＯ−Ｃｈｐ１Ｃｄ（野生型およびＬＯＯＰ１Ｂ／２ｂ変異体）を、１ ５μ ｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させ、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３ヌクレオソームを添加して、結合緩衝液（２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７． 結合緩衝液５ ０μ ｌで３回洗浄した後、２ｐｍｏｌの３ ２Ｐ標識１ ０ ０ｎｔ ＤＧ ＲＮＡを添加し、氷上でＣｈｐ１Ｃｄ−ヌクレオソーム樹脂と１時間インキュベートした。 樹脂を少なくとも3×(v/v)結合緩衝液で3回洗浄し、Chp1Cd-ヌクレオソーム-RNA複合体を300mMイミダゾール緩衝液(20mM HEPES pH7.5、75mM KCl、0.5mM DTT、300mMイミダゾール) 試料を、１ ０％Ｔｂｅ天然アクリルアミドゲル（ビス−アクリルアミド比１：２ ９）上に負荷し、４℃で１ ０ｍＡで２時間実行した。
クロマチン免疫沈降
酵母培養物（100ml）をOD600 0.7まで成長させ、記載されているように室温で3％ホルムアルデヒドと15分間架橋した。 反応物を125mMグリシンで室温で10分間クエンチした。 細胞を500μ lの溶解緩衝液(50mM HEPES pH7.5,1)に再懸濁した。5M酢酸ナトリウム、5m M Mgcl2、2m mエチレンジアミンテトラ酢酸、2m mエチレングリコール四酢酸、0.1%NP-40、20%グリセロール）含有プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル錠、ロシュ、完全、エチレンジアミンテトラ酢酸フリー）。 凍結細胞をＭＰ Ｂｉｏｓｐｅｃビードビーターを用いて溶解した。 溶解後、抽出物を３ ５×３ ０秒間超音波処理し（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ，Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１ ３ ０ ０ ０ｇで１ ５分間回転させてクロマチン上清を得た。 入力ＤＮＡには、５ ０μ ｌの上清を使用した。 免疫沈降のために、上清をタンパク質濃度に基づいて正規化し、抗ジメチル化Ｈ３Ｋ９抗体または抗Ｃｈｐ１抗体（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２、Ａｂｃａｍ ｎｏ． Ab1220およびChp1、Abcamいいえ。 ビーズおよび固定化されたタンパク質を、１ｍｌの溶解緩衝液で５回洗浄した。 タンパク質は、150μ lの溶出緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.0、10mM ethylenediaminetetra酢酸、1％ドデシル硫酸ナトリウム）と65℃で15分間インキュベートすることによって溶出した。 架橋は、rnase AとプロテイナーゼKとタンパク質分解とRNA分解に続いて一晩65℃でインキュベーションによって逆転した。DNAは、フェノール–クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって回収され、qPCRを用いて定量化された。 真染色性遺伝子tdh1は、正規化のために使用されました。 クロマチン免疫沈降アッセイで使用されるオリゴヌクレオチドは、補足表S2に記載されています。
ヌクレオソームin vitro再構成と(H3K9Me3)メチル化
ヌクレオソームは、前述のようにアフリカツメガエルlaevisヒストンと601配列を使用して再構成されました。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化は記載のように行った。 +42Daのピークは、元の出版物で観察されており、それは汚染ではありません（Matt Simon、personal communicationおよびで説明されています）。＜1657＞＜6596＞In vitro Chp1Cd–H3K9Me3Mlaヌクレオソーム複合体の形成と溶出＜9781＞＜1767＞合計で、5μ gのChp1Cdを結合緩衝液（20mM HEPES pH7.5、75mM KCl、0.5mM DTT、20mMイミダゾール）中の15μ lのNi-NTA樹脂に4℃で20分間結合させた。 樹脂を５容量の結合緩衝液で１回洗浄し、１ ０μ ｇのＨ３Ｋ９Ｍｅ３メチルリジンアナログ（ＭＬＡ）ヌクレオソームを加え（ｍｌａヌクレオソームを結合緩衝液中で予め透析した）、２ ０μ ｌの最終容積で、５分毎に一定の再懸濁液で氷上で１時間インキュベートした。 インキュベーション後、樹脂を遠心分離し（１ ０秒間６ ０ｇ）、フロースルーを回収した。 次いで、樹脂を５容量の結合緩衝液で３回洗浄した。 ＳＵＭＯ−Ｃｈｐ１Ｃｄ−Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３ヌクレオソーム複合体を、２ ０μ ｌの結合緩衝液中の氷上でトロンビン（Ｓｉｇｍａ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を２時間添加することによって溶出した。 複合体形成は、その後、15％アクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および陰性染色EMによって評価された。合計で、１μ ｇの−ヒストンＨ３（１−２ １）−ＧＧＫ（ビオチン）ペプチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を、１ ５μ ｌのストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７． 次いで、約５μ ｇのＣｈｐ１Ｃｄ（ｗ Ｔおよび突然変異体の両方）を最終容量２ ０μ ｌ中に添加し、同じ緩衝液条件下で氷上で１時間インキュベートした。 樹脂を三回洗浄し、その後、結合効率は、15％アクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で評価した。 結合の定量は、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを使用して行った。 各変異体の結合を、各アッセイについてｗｔ Ｃｈｐ１Ｃｄに対して正規化した。
Mscale thermophoresis(MST)
Mst SUMOタグはUlp1プロテアーゼを用いたChp1Cd構築物から除去された。 合計で、１ ０ ０μ ｇの野生型および突然変異体Ｃｈｐ１Ｃｄを、ｍｏ−Ｌ０ ０ ３Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＢＬＵＥ−ＮＨＳ（Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ）を使用して、製造業者の指示書（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って蛍光標識した。 1:1蛍光：タンパク質比はNanodrop1000ソフトウェア”タンパク質とラベル”機能を使用して推定され、各Chp1クロモドメインは15％SDSアクリルアミドゲル上で実行され、0.1mg ml−1に濃度を正規化した。
反応は、20μ lで300ngの蛍光Chp1Cd、および-ヒストンH3(1-21)-GGK(ビオチン)ペプチド(Eurogentec)またはH3K9Me3ヌクレオソームの量を増加させ、10mMトリス-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.5mM DTTおよび0.05%Tween-20を含む緩衝液中で組み立てた。 H3K9Me3ヌクレオソーム結合アッセイのグリセロールは10％の最終concentractionに追加されました。 H3K9Me3アッセイの場合、これらの希釈を測定に使用した：0nM、9nM、13nM、20nM、31nM、46nM、70nM、105nM、158nM、237nM、355nM、530μ M、800μ M、1.2μ M、1.8μ M。 H3K9Me3ヌクレオソームアッセイのために、我々は、測定のために以下の希釈を使用した：0nM、18nM、27nM、41nM、62nM、93nM、140nM、210nM、316nM、474nM、711nM、1.06μ M、1.2μ M、1.4μ M、1.6μ M、2.4μ M。＜１ ６ ５ ７＞＜１ ７ ６ ７＞ＭＳＴの実行は、ＮＴ上で標準処理された毛細血管（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｃａｔ＃Ｋ０ ０ ２）を用いて行った。115モノリス楽器. すべての測定は、80％のLEDおよび40％のMST電力を使用して、30秒のレーザオン時間および5秒のレーザオフ時間で実施した。 各実験について、五つの単一の測定を行った。
データはGraphPad Prismソフトウェアバージョン6で解析した。０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ））およびＳｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアバージョン１ ３． ペプチド結合アッセイのために、明確なシグモイド傾向を示す曲線で、我々はRichardsファイブパラメータロジスティック非対称シグモイド方程式を適合させ、自 H3K9Me3ヌクレオソーム結合アッセイのために、生データの傾向はもはや分析されたすべてのタンパク質のためのシグモイドではなかったとして、三次多項式（立方）式は、野生型Chp1Cdと異なる変異体の生データポイントをフィッティングし、比較するために使用されました。 Ｋｄは、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアの「補間」特徴に基づいて、ｙ軸上の５ ０％境界／非境界値を使用して計算した。
ヌクレオソームトリプシン消化
テールレスヌクレオソームは、20mM HEPES pH7.5、75mM KCl、0.5mM DTTを含む緩衝液中で室温で固定化TPCK-トリプシン樹脂（Thermoscientific）と再構成されたヌクレオソームを2時間インキュベートすることによって調製した。 トリプシン消化は非常に定義されたヒストンバンドを生成し、正確にトリプシンが切断する場所を詳細に特徴づけられている。
Chp1Cd変異体によるヌクレオソーム結合アッセイ
chp1Cd野生型および変異体ヌクレオソーム結合アッセイは、20mM HEPES pH7.5、100mM KCl、0.5mM DTT、40mMイミダゾールにおけるChp1Cd-H3Kc9Me3MLAヌクレオソーム複合体形成について前述のように実施した。 樹脂および入力は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動15％アクリルアミドゲル上で実行した。 次いで、全ての試料を、抗Ｈ３ヒストン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１：１ ０ ０ ０）または抗Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３抗体（Ａｂｃａｍ，１：１ ０ ０ ０）、抗ヤギＩｇｇ−ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ，１：３ ０ ０ ０）抗ウサギＩｇｇ−ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１：１ ０ ０ ０）を用いてｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔにより分析した。:3000).
陰性染色電子顕微鏡
トロンビン溶出後、3μ lのChp1Cd–H3Kc9Me3ヌクレオソーム複合体を、1nmの炭素膜でコーティングされたグロー放電銅グリッド（Cu400mesh Q11916、Quantifoil、Großlöbichau、Germany）上に45秒間 陰性染色像をＦＥＩＭＯＲＧＡＧＮＩ透過型電子顕微鏡で収集した。
Cryo–EM Chp1Cd-H3Kc9Me3ヌクレオソーム複合体
Cryo-EMグリッド（Holey carbon-coated grid、Cu300Mesh R3/3+1nm carbon layer、Quantifoil）上にVitrobot Mark IV（FEI Company）を用いて調製した。 Ｃｒｙｏ−ＥＭデータを、Ｔｉｔａｎ−Ｋｒｉｏｓ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて２ ０ ０Ｋｅｖで収集し、Ｆ８ １ ６ＣＭＯＳカメラ（ＴＶＩＰＳ Ｇｍｂｈ，Ｇａｕｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＣＤの平面で１ １ ３ ０ ０ ０×の倍率で収集し、物体スケールで１． 自動化されたデータ収集のために、ＥＭ−ＴＯＯＬＳソフトウェアを使用し、１ ０ ０ ０ ０〜４ ０ ０ ０ ０Åの焦点ずれ範囲でデータを収集した。
合計で、Chp1Cd–H3Kc9Me3複合体の2 480顕微鏡写真とH3Kc9Me3ヌクレオソーム対照の991顕微鏡写真は、それぞれ、Xmippソフトウェアパッケージを使用して単粒子分析のために選択された（補足図S9A）。 数千の粒子を手動でピックアップし、慎重にノイズから洗浄しました。 これらの粒子は、その後、XMIPPで半自動および自動粒子ピッキングに使用されました。 コントラスト伝達関数はCTFFIND3によって決定された。 選択された単一粒子を、さらなる分析のためにＳＰＵＤＥおよびＲＥＬＩＯＮ形式に変換した（補足図Ｓ９Ｂ）。 二次元クラス平均は、RELIONソフトウェアパッケージ（補足図S9C）を用いて生成された。 悪いクラス平均は、さらなるデータ分析から削除されました。 三次元の改良は、その後、SPIDERとRELIONのソフトウェアパッケージで行われました。
教師なし粒子分類は、SPIDERソフトウェアパッケージで焦点を当てた分類なしで完全な密度マップを使用してランダムシードによって実行されました。 焦点を当てた分類を使用しようとすると、関心のある領域で強いバイアスとノイズが過剰に適合しました。 したがって、バイアスを減らすために焦点を当てた分類を使用しませんでした。 SPIDERで行われた最初の分類では、クラスC0–C6とN0–N5は、C0とN0マップからの角度を使用して逆投影され、このクラスは完全に洗練されていませ ここでは、ヌクレオソームに結合した追加の密度を持つクラスを選択したかっただけです。 異なるChp1Cd密度を持つマップを生成する粒子を分離し、さらに分類した。 粒子を五つの異なるグループに分割するまで、約20回のランダム播種分類を行った（補足図S3）。 クラスC11-C15はRELIONのソフトウエアパッケージと精製されました。 Chp1Cd-H3K9Me3ヌクレオソーム複合体（C15クラス）とヌクレオソーム制御の最終的な改良は、RELIONソフトウェアパッケージで行われました。 最終的な精製のために、基準を〜５ ０Å（ＲＥＬＩＯＮ ｆｉｌｔｅｒ）に濾過した。 我々が使用した参照は、洗練された再構成において観察された特徴のいずれも有していなかった（ＤＮＡ二重らせんは分解されず、主要な溝は見えず、α−らせんは分解されない）。 これは、私たちの構造には基準バイアスがないことを示しています。 ヌクレオソーム制御の分解能は、RELIONとC2対称性（fsc0.143二つの独立して洗練されたマップのカットオフ）で自動精製を使用して7.3Åに達しました。 Chp1cd-H3K9Me3ヌクレオソーム複合体は、対称性が適用されないと10Å（fsc0.143二つの独立して洗練されたマップのカットオフ）に洗練されました。
ResMapソフトウェア（最終シングルボリューム、minRes=7、maxRes=14、automask）を使用してローカル解像度を計算しました。 Resmapによって決定された平均分解能は、Chp1Cd-H3K9Me3ヌクレオソーム複合体の9.4Åであり、以前に決定された平均分解能10Å（FSC0.143）を独立して確認している（図1c）。 Chp1Cd-H3K9Me3ヌクレオソーム複合体の場合、ヌクレオソームの局所分解能は9-10Å、リガンドは-10Åである（図2a）。 最終的な再構成のためのオイラー角分布は、ヌクレオソームとChp1Cd-H3K9Me3ヌクレオソーム複合体の両方について示されている（補足図S9D）。 すべての方向は上および側面図のための好みとある。
分子モデルは、結晶構造の剛体フィッティングを用いたキメラソフトウェアパッケージを用いて構築された。 密度への適合は、キメラオプション”マップ内の適合”と”セグメント内の適合”で行われ、わずかな手動調整のみが行われました。 すべてのcryo-EMマップのセグメンテーションと可視化は、キメラソフトウェアでも行われました。