Chelex樹脂を使用して乾燥した血液スポットからDNA抽出を実行する方法

DNAを分析したいすべての生物科学者は、プロセスが目的の細胞からDNAの抽出 これらの細胞は、いくつかの名前に赤血球、寄生虫、または細菌である可能性があります。 さらに、サンプルの種類や下流分析などに応じて、さまざまなDNA抽出方法1から選択することができます。 多くの科学者は、乾燥した血液スポット（DBS）から始まり、そのようなサンプルからDNAを抽出する方法は特に興味深いものです。 DBSは、一般的に、Whatman FTA card2またはWhatmanクロマトグラフ3mm濾紙に血液を採取し、処理する前に一定期間（〜4時間）乾燥させることによって調製される。 生物見本抽出のこの方法は十年の間使用されました。

BT Chelex100Resin3を用いてこのようなサンプルからDNAを単離するための有用な方法を以下に記載する。

ステップ1：赤血球溶解

• 乾燥した血液スポットを切り取り、穴あけ器を使用してマイクロ遠心チューブ（1.5ml）に入れます。 特に複数のサンプルで作業する場合は、チューブにラベルを付けることを忘れないでください。 品質管理の為に、また肯定的な制御血の点を含んで下さい。
• 血液スポットを含むマイクロ遠心チューブに1mlの0.5%サポニンを加えます。 閉じ、渦、および4 0℃で少なくとも4時間、またはより良いまだ、一晩インキュベートする。 このステップでは、サポニンは赤血球膜中のコレステロールと複合し、膜中の細孔の形成およびそれゆえの溶血をもたらす。4サポニンは、赤血球から寄生虫（例えば、マラリア原虫）を解放する際に一般的に使用される溶解試薬である。
• 4,000rpmで数秒間回転し、内蓋から滴を取り除き、真空組立機のパスツールピペットに取り付けられた非バリアピペットチップを使用してサポニンを管から吸引する。 プラスチック製のパスツールピペットも使用できます。 マイクロ遠心管にスポットを残します。

ステップ2：洗浄

• リン酸緩衝生理食塩水1mlをマイクロ遠心に加え、閉じて渦を作り、4 0℃で20-30分間インキュベートする。 一晩インキュベートしても害はありません。 このステップはサポニンが管から取除かれることを保障します。
• は4,000rpmで数秒間回転し、その後、サポニンを除去したのと同じ方法でPBSを除去します。 マイクロ遠心管にスポットを残します。

ステップスリー:Chelex樹脂によるDNA抽出

原則:Chelex樹脂は、分解酵素(Dnase)および下流分析を阻害する可能性のある汚染物質からのDNA分解を防止することによ 一般に、キレックスレジンは、そのような汚染物質を捕捉し、ＤＮＡを溶液中に残す。 Chelexの樹脂はMg2+のようなカチオン、DNaseの行為のための重要な補因子を阻止し、それ故に低下からDNAを保護します。5,6

• ピペットは点を含んでいるmicrocentrifugeの管に6.7%Chelexの樹脂の解決の150μ lを加え。 チューブを閉じます。 重要なメモ:6.7%Chelexの解決を準備するとき、DNases、nucleases(またはDNAに害を与え、低下させるかもしれない何でも)から自由である水を使用しなさい。
• ヒートブロック/シェーカーを用いて95 0℃で10分間インキュベートする。 圧力を解放するために管を、2分毎に二度開け、次に数秒間その後振ることは重要です。 これは解決にDNAを解放します。

ステップ四：最終抽出物にキレックスレジンビーズを避ける

• 5分間4,000rpmでスピン
• キレックスビーズの転送を避けながら、エアロゾルバリアチップを使用して、より小さなマイクロ遠心チューブ（0.6ml）にできるだけ多くの抽出物をピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットで
• 0.6mlマイクロ遠心機を4,000rpmで10分間遠心分離する。 第2回転の考えは最終的なエキスに引き継ぐかもしれない残りのChelexのビードを取除くことである。 なぜこれが重要なのですか？ 二つの主な理由：1）キレックスはマグネシウムイオン（PCRで使用されるTaqポリメラーゼのための必須補因子）に結合し、2）キレックスは蛍光を発する。 蛍光が結果を視覚化する方法である場合、これは偽陽性を引き起こす可能性があります。
• 約100μ lをピペットでピペットし、最終抽出物を新しいマイクロ遠心に移します。 ラベルを付けて冷蔵庫に保管してください。

DNA抽出をしながらいくつかのヒント

• 汚染物質のない清潔な環境で作業
• ヌクレアーゼのないピペットのヒントを使用
• 手袋ですべてのサンプルを処理
• 再び、最終的な抽出物にキレックスビーズを避けてください

結論

Chelex Resin7は、さまざまな分子分析アプリケーションで使用するためのDbsからの簡単で迅速なDna抽出方法を提供します。 この方法は高価な装置を必要とせず、他の方法に対して試験したときに信頼性があります。

1. GEヘルスケア（2010）。 Whatman FTAカードからのDNAの信頼できる抽出。 アプリケーションノート28-9822-22AA。 バッキングマシャー、英国：GEヘルスケア。
2. Whatman(n.d.). DNA分析のためのFTAディスクの準備。 Watman FTAプロトコルBD08.
3. Bio-Rad(n.d.)Chelex®100およびChelex20キレートイオン交換樹脂取扱説明書。 リト-レヴュー ヘラクレス、カリフォルニア州：バイオラッド研究所。
4. Baumann,E.,Stoya,G.,Völkner,A.,Richter,W.,Lemke,C.,Linss,W.(2000). サポニンによるヒト赤血球の溶血は、膜構造に影響を及ぼす。 Acta Histochemica,102(1),21-35.
5. IBRC(2016). 抽出プロトコル：Chelex。 IBRCのウェブサイト。 http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara,C.S.,Boissaye,R.,Stewart,J.,And Staton,P.(n.d.)から取得しました。 参照の口頭綿棒のためのChelex®DNAの抽出の議定書の開発そして内部確認。
7. Walsh,P.S.,Metzger,D.A.,Higuchi,R.(2013). Biotechniques30Th Anniversary Gem Chelex100法医学材料からPCRベースのタイピングのためのDNAの簡単な抽出のための媒体として。 Biotechniques,54(3),134-139.