染色体バンディングおよびペインティング
骨髄性疾患を有する107例の骨髄染色体調製をGバンディングによって分析した。染色体20の長腕の欠失の大きさを評価する。 前述のように（Ｎａｃｈｅｖａ ｅ ｔ ａ ｌ．,1995b),20q欠失の二つのカテゴリが同定されました–大欠失(59例),20qからのGiemsa暗いバンドの両方の損失をもたらします(図1a,上),と小欠失(48例)一つのGiemsa暗いバンドが残っています(図1a,下). 次に、後者の患者群に焦点を当てた（表1に要約）。
Gバンディング、染色体の絵画および遺伝子座の特定の調査による20q欠失の分析。 (a)長腕の大きな欠失（上のペア）と小さな欠失（下のペア）を示す正常（左）と欠失（右）染色体20相同体のGバンド部分核型。 (b)15番染色体(赤)と20番染色体(緑)とハイブリダイズされた骨髄中期細胞は、gバンディングによってdel(20)(q11)として同定されたマーカー染色体(矢印)が実際には15番染色体に由来することを示す塗料である。 （c）骨髄中期細胞は、gバンディングによってdel（20q）として同定されていた染色体20（矢印）を含む不可解な転座の存在を示す染色体20塗料（赤）とハイブリダ (d)del(20)(q11.2q13.2)を持つ患者からの骨髄中期細胞は、両方の染色体20相同体のみにハイブリダイゼーションを示す染色体20塗料とハイブリダイゼーション。 (e)MDS患者DB122からの部分骨髄中期細胞は、染色体20動原体プローブ（赤）とPAC dj620e11（緑）正常および削除された（矢印）染色体20相同体の両方にPAC dj620e11のハイブリダイ (f)患者DB122からの部分骨髄中期細胞は、染色体20動原体プローブ（赤）とpac dj661i20（緑）del（20）（q11.2q13.1）（矢印）上の緑のシグナルの不在を示すとハイブリダイズした。 (g)mds患者DB214の部分骨髄中期細胞は、染色体20動原体プローブ（赤）とPAC dj242a14（緑）とハイブリダイズしました。 Del(20)(q11.2q13.1)(矢印)に緑色の信号がないことに注意してください。 （h）mds患者DB214からの部分骨髄中期細胞は、染色体20動原体プローブ（赤）とPAC dj196h17（緑）正常および削除された（矢印）染色体20相同体の両方に赤と緑のシグ
染色体20塗料を用いた魚の分析は、小さな20q欠失を有する48サンプルに対して行われた。 六つのケースでは、”20q欠失”は不可解な再配列によるものであることが明らかになった。 あるケースでは、15番染色体と20番染色体に塗料を同時に塗布すると、15番染色体に由来するマーカーが同定されましたが、2つの正常な20番染色体同族体が同定されました(図1b)。 残りの5例では、染色体塗装は、20q11.2と可変染色体パートナーで再発ブレークポイントと不均衡な転座の存在を示した（図1c）。 すべての五つのケースでは、der(20)マーカーは、ゲノムに保持されている唯一の転座産物であった。 さらに、ＦＩＳＨマッピングは、染色体２ ０上のブレークポイントがＤ２ ０Ｓ１ ０ ７に近位の領域で発生し、染色体２ ０の長腕の残りの部分の喪失を確認したことを示した（ これらの結果は、他の場所で詳細に報告されます。
残りの42例では、染色体塗装は20qの小さな間質欠失と一致していた（図1d）。 大多数（33例）は、唯一の核型異常として20q欠失を行った。 残りの九例では、20q欠失は、様々な追加の染色体異常を伴っていた（表1）。 小さな20q欠失を有するすべての42例は、遺伝子座特異的プローブを用いたさらなる魚のマッピングを行った。
欠失マッピング解析
小さな20q欠失を有する42人の患者は、動原体PAC（CEP20）、20qの遠位領域へのpacハイブリダイズ（LSI20q13）およびCDR内のPACハイブリダイズ（LSI D20S108）を用いてFISHによって分析された。 各患者において、ｌｓｉ２ ０ｑ１ ３およびＣＥＰ２ ０の両方からのシグナルが観察されたが、ｌｓｉ Ｄ２ ０Ｓ１ ０ ８は観察されず、欠失染色体２ ０上で間質欠失の存在を確認した（図３ 次に、各患者からの中期を、既知のＭＰＤおよびＭｄｓ／ＡＭＬ Ｃｄｒ−Ｄ２ ０Ｓ１ ０ ７の境界でのＰａｃｓマッピングとハイブリダイズし、Ｃｄｒの近位境界のテロメアにあるＤ２ ０Ｓ１ ７ ６（Ｂｅｎｃｈ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ８ａ；Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998).
マッピングデータの概要。 この図は、新しいMDS/AMLおよびMPD Cdrの描写を可能にするFISHおよびマイクロサテライトPCRの結果を提示する。 患者は、マイクロサテライトPCRが行われた患者RB42を除いて、遺伝子座特異的プローブを有する魚によって分析された。 マイクロサテライトＰＣＲは、患者Ｍ Ｈ４ ０およびＪ Ｈ４ １に対して以前に実施されていた（Ｂｅｎｃｈ ｅ ｔ ａ ｌ．、1998a）。 STSマーカーと対応するPACsは、左側に示されています。 メガベースまたはセンチメートル単位のマーカー間の距離が示されています。 括弧で囲まれたマーカーは、0.1Mb未満で区切られています。 ＭＰＤ ＣＤＲの遠位境界は、以前に報告されている（Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998). ＭＤＳ／ＡＭＬ ＣＤＲは、Ｐａｃｓ ＤＪ６ ２ ０Ｅ１ １およびＤＪ１ ９ ６Ｈ１ ７によって隣接している。 ＭＰＤ ＣＤＲは、ｄｓ２ ０Ｓ１ ０ ８およびＤ２ ０Ｓ４ ８ １によって隣接される。 患者ＤＢ２ １ ４はまた、Ｐａｃｓ ＤＪ１ ４ ９Ｄ２ ０（Ｄ２ ０Ｓ４ ８ １）、ＤＪ８ １Ｏ８（Ｄ２ ０Ｓ４ ５ ４）、ＤＪ２ ０ ７Ｎ８（ＳＴＳＧ３ ４ ０ ７ ９）およびＤＪ７ ３ ４Ｂ２ ３（ＷＩ−４ ２ ５ ５）の保持を示した（データは示さず）。)
37人の患者（MDSまたはAMLの25、MPDの12）では、両方のプローブは、Cdrを精製するのに役立たない広範な欠失の存在を示す欠失染色体20上のシグナルを生成するこ そのような試料はさらに調査されなかった。 しかし、MDS（DB53、MH40、DB122およびDB214）およびMPD（JH41）を有する四つの患者では、二つのプローブの一つは、削除された染色体20上のシグナルを与え、これらのサンプ
遺伝子座特異的プローブを用いてFISHによって分析された小さな20q欠失を有する42人の患者に加えて、骨髄中期が利用できなかった20q欠失を有するさらなる6人の患者（MDSを有する4人、MPDを有する2人）をマイクロサテライトPCRを用いて分析した。 精製された顆粒球およびＴ細胞からのＤＮＡを、ＭＰＤおよびＭＤＳ／ＡＭＬ Ｃｄｒにまたがる多型マーカーの大きなパネルを用いて分析した（表２）。 ４人のＭＤＳ患者はすべて，公表されたＣＤＲの限界を超えた欠失を有していた。 しかし、2人のMPD患者のうちの1人（RB42）では、欠失の動原体境界はMPD CDRをかなり減少させた（図2、表2）。
新しいMPD共通の削除された領域の近位境界を定義するマイクロサテライトPCRの結果。 マイクロサテライトPCRは、患者RB42から精製された顆粒球（G）およびT細胞（T）から抽出されたDNA上の示されたマーカーを用いて行われた。 矢印は、各対立遺伝子の上部バンドを示す。 開いた矢じりは、顆粒球中で欠失された対立遺伝子を示す。 一つの対立遺伝子はD20S858とD20S46で失われているのに対し、二つの対立遺伝子はD20S108で保持されています
Mds/AML患者における共通欠失領域の減少
予備FISH分析により、mds/AML CDRを侵害する欠失を有する4人のMDS患者が同定された。 それぞれの場合において、20q欠失は、検査されたすべての中期に存在していた。 三つのケース（DB53、DB214およびMH40）では、20q欠失は唯一の異常として存在していた。 患者DB122では、20q欠失は、トリソミー21またはトリソミー8およびトリソミー21を含む二つのサブクローンと元の唯一の異常であり、20q欠失に加えても存在する。 これら四つの症例を，欠失境界を確認するために追加の遺伝子座特異的プローブを用いて研究した。＜３ ３ ０ １＞＜５ ６＞ＭＤＳ／ＡＭＬ ＣＤＲの近位境界は、患者ＤＢ５ ３、Ｍ Ｈ４ ０およびＤＢ１ ２ ２によって精製された。 DB53における欠失の近位境界は、D20S107とWI-11538の間にあり（図3）、約400kbの距離である。 患者Ｍ Ｈ４ ０について、ＷＩ−１ １ ５ ３ ８（ＤＪ３ ５ ７Ｅ１ ４）を含むＰＡＣは、一貫して、このＰＡＣ内の近位欠失ブレークポイントの存在と一致する減少した信号を生じさせた（図３）。 さらに、患者のDB122における欠失の近位境界は、sts-R52161とSTSG25449との間にあり（図1e、f）、200kb未満の距離（図3および4）であった。 これは、ＭＤＳ／ＡＭＬ ＣＤＲの近位境界の大きな微細化を表す。
細菌クローンのコンティグの概要. この図は、コンティグを構成するPACおよびBACクローンの代表的なサンプルを示しています。 配列決定に使用されるタイルパスの一部であるクローンは、通常のタイプで示されています。 ＭＤＳ／ＡＭＬ ＣＤＲは、ＤＪ６ ２ ０Ｅ１ １とＤＪ１ ９ ６Ｈ１ ７との間の２． ２つのＣｄｒ間の重複領域のサイズは１． すべてのPACs、BACsおよびマーカーが示されているわけではありません。 Dj128o17とdj272h18の間の完全なマップの一部が示されています。 完全な地図はhttp://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_20ctg125&class=Mapで見ることができます
患者DB214は、MDS/AML CDRの遠位境界のかなりの洗練を可能にした。 この欠失の遠位境界は、ＷＩ−１ ２ ５ １ ５とＳＴＳＧ４ ０ ３ ６ ９（図１ｇ、ｈ）との間にあり、１ ０ ０ｋｂ未満の距離である（図３および図４）。したがって、これらのデータは、mds/AML CDRをsts-R52161を含むPAC DJ620E11と、WI-12515を含むPAC DJ196H17の間にある領域に大幅に削減します（図3および図4）。 以下に示す細菌クローンcontigは、この領域の物理的なサイズが約2.6Mbであることを示しています。
MPD患者における共通欠失領域の減少
患者JH41（診断PV）において、欠失の近位境界は、以前にマイクロサテライトPCRによってD20S438とD20S107の間にあることが決定されていた（Bench et al.、1998a）。 D20S107を含むPAC dj155h19（図4）は、このPAC内の近位欠失ブレークポイントの存在と一致する減少した信号を一貫して生じさせた（図3）。＜３ ３ ０ １＞＜５ ６＞２人の追加の患者からの顆粒球およびＴ細胞を、マイクロサテライトＰＣＲを用いて調べた（表２）。 PV（RB42）を有する1人の患者は、D20S108でのヘテロ接合性の保持を示したが、D20S858での損失を示した（図2、表2）。 この患者における欠失の近位ブレークポイントは、D20S108とD20S858の間にあり、200kb未満の距離であった（図3および4）。＜３ ３ ０ １＞＜５ ６＞これらのデータは、現在、Ｄ２ ０Ｓ１ ０ ８（本研究）およびＤ２ ０Ｓ４ ８ １（Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ９ ９）に隣接しているＭＰＤ ＣＤＲを大幅に減少させる。, 1998). この領域の推定物理的なサイズは2です。以下に示す細菌クローンcontigからのデータを使用して、7Mb。 新しいMDS/AMLとMPD Cdrとの間の重複領域は、1.7Mbの複合「骨髄性」CDRを定義した（図3）。
MPDおよびMDS/AML共通の削除された領域にまたがる細菌クローンcontig
我々は以前に11Mb yac contig染色体20のこの領域を構築していた(Bench et al.、1998a）。 より詳細な物理マップを生成するために、我々は今、連続したPACとBACベースのマップを構築しました。 ＰＡＣおよびＢＡＣクローンは、ゲノムライブラリーへのＳｔｓｓのハイブリダイゼーションによって同定された（Ｉｏａｎｎｏｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1994; オソエガワ他, 1998). クローンは、制限フィンガープリントを使用して重複した（Gregory et al.,1997)およびSTSコンテンツマッピングにより、クローンを連続体にグループ化することができます。 連続体を橋渡しするために、連続体の端から開発された新しいStsおよびDNAプローブは、さらなるライブラリスクリーニングのために使用された。 次に、連続したマップが生成されるまで、新しいＰａｃｓおよびＢａｃｓを同じ方法で連続したマップに合併させた。
細菌クローンのコンティグには合計456個の細菌クローンが含まれており、そのうち376個がPACs、80個がBacである。 それはD20S607からSEMG1まで伸び、202のDNAマーカーを含み、そのうち185はSTSsであり、17はDNAプローブである。 コンティグのサイズは、HindIII指紋バンドあたり平均3.5kbに基づいていた（P Deloukas（2000）、未発表の結果）。 コンティグの推定サイズは、コンティグ内の異なる指紋バンドの総数に3.5を乗じて5Mbとして計算されました。 魚の実験に使用された最小タイルパスとPACsを示すマップの表現を図4に示します。 マップの完全版はhttp://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_-20ctg125&class=Mapで見つけることができます。
発現配列の同定
四十から三ユニークなESTsは、包括的にD20S607とstsg34035の間に位置していました。 これらのうち、34個のEstを、PACsとBacの「ポリグリッド」へのハイブリダイゼーション、またはPACsまたはBacを含む細菌コロニーのコロニー PCRによってマッピングした(図4)。 これまでに染色体２ ０のこの領域にマッピングされた、追加の９つのＥｓｔ（Ｂｅｎｃｈ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ８ａ；Ｄｅｌｏｕｋａｓら、１ ９ ９ ８ａ；Ｄｅｌｏｕｋａｓら、 ら、１ ９ ９ ８）を、ＥＳＴ配列と利用可能なＰＡＣまたはＢＡＣゲノム配列とのＢＬＡＳＴアライメントによってコンティグ上に配置した。
推定される新規発現配列を同定するために、最小タイリングパスから23PACクローンを部分的または完全に配列決定した。 これらのクローンのゲノム配列を、ＮＩＸプログラムを用いて分析した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ＧＲＡＩＬ、ＧＥＮＳＣＡＮおよびＢＬＡＳＴを含む多数の遺伝子同定ツールの同時観察を可能にする、１ ９ ９ ８）。 ８つの以前にマップされていないＥｓｔおよび遺伝子を同定した（表３）。 これらのうちの６つはＭＰＤ ＣＤＲ内にあり、７つはＭＤＳ ＣＤＲ内にある。 エビデンスは、これらの推定発現配列のうち六つは、estデータベース内の偽遺伝子またはゲノムDNA汚染物質を処理するのではなく、善意の転写遺伝子を表 KCNS1は、カリウム電圧ゲートチャネルサブユニットをコードする遺伝子である。 ＥＳＴ Ａ Ａ０ ５ ３ ２ ０ ６／Ａ Ａ０ ５ ３ １ ２ １は、続いて、ＳＧＫ２遺伝子に由来することが見出された（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1999). ゲノム配列へのcDNA配列のアライメントは、すべてのエクソン/イントロン境界に存在するスプライスサイトコンセンサス配列と残りの六つのESTs（AI312497、AA568401とAA910031）の三つのエクソン/イントロン構造を示した。 これらの三つのケースのすべてにおいて、各エクソンの存在は、GRAILなどのエクソン予測プログラムによって確認された。 エクソンの存在はまた、このESTも転写された遺伝子を表すことを意味するEST AA993161に整列したPAC DJ1108D11の領域内のGRAIL、GENSCANおよびGenefinderによって予測された。
最小タイリングパス内からのＰａｃｓの配列解析により，この領域における既知および新規遺伝子のゲノム構造を確立することができた。 PACs dj1121h13、dj707k17、dj81g23、dj230i19、dj3e5、dj232n11およびdj269m15へのRPTPrho cDNAのアライメントは、この遺伝子が少なくとも1.2Mbに及ぶことを示した。 PAC dj138b7は、二つの遺伝子（h-l（3）mbtおよびSGK2）だけでなく、SHGC-36858に対応する遺伝子の5’部分を含んでいました。 特に、theh-l(3)mbt遺伝子は、二つの推定代替最終エクソンと20エクソンが含まれています。 Dj644l1の分析は、ヒトMafB遺伝子が単一のエクソンで構成されていることを示した。 完成した配列の分析もSanger Centre（http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana）によって行われ、これはhttp://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequenceで見ることができます。
これらのデータにより、新しいMDS/AML CDR内に6つの遺伝子とさらに14個のunqiue Estが存在し、新しいMPD CDR内に23個のユニークEstを持つ合計14個の遺伝子が確 六つの遺伝子と10のユニークなESTsは、二つのCdrの間の重複の領域に存在しています。
発現プロファイリング
骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病は、造血幹細胞コンパートメント内の多能性細胞の形質転換に起因すると考えられている(Bonnet and Dick,1997;Kralovics and Prchal,1998)。 さらに、20q欠失は、骨髄系細胞およびB細胞の両方を生じさせることができる前駆細胞において生じ得ることが以前に示されている（White et al., 1994). これらの考察は、これらの疾患で不活性化されている染色体20q上の遺伝子または遺伝子が正常な造血前駆細胞で発現する可能性が高いことを示唆 したがって、我々は、転写された配列のどれが骨髄および精製されたCD34陽性細胞で発現されたかを決定した。
逆転写PCR(RT–PCR)増幅は、転写された51配列のそれぞれを表すプライマーで行った(図5)。 転写された各配列について、少なくとも２つの独立したＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。 ＣＤ３ ４遺伝子の３’ＵＴＲに由来するＥＳＴ（ＷＩ−７ ６ ８ ５）に対応するプライマーを陽性対照として使用した（図５）。 ２つ以上のＥｓｔが同じ転写配列に対応する場合、各ＥＳＴについて同じ結果が得られた。
コンティグ内の遺伝子の発現解析。 ＲＴ−ＰＣＲデータは、コンティグ内の３つのＥＳＴマーカー（ＡＩ３ １ ２ ４ ９ ７、ＳＴＳＧ３ ０ ３ ２、Ａ Ａ７ １ ６ １ ６ ５）およびＣＤ３ ４遺伝子の３’ＵＴＲに由来するＥＳＴであるＷＩ−７ ６ ８ ５について示される。 ＲＴ−ＰＣＲは、２人の正常個体（Ｂ Ｍ）の骨髄細胞またはさらなる正常個体（ＣＤ３ ４＋）のＣＤ３ ４陽性細胞由来のＲＮＡを用いて実施した。 PCR産物のサイズが示される。 Ｒｔ、逆転写酵素の存在下で行われる逆転写；−ｒｔ、逆転写酵素なしで行われる模擬逆転写；−ｖｅ、ＤＮＡなしでのＰＣＲセットアップ；＋ｖｅ、ゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲセットアップ
データは、図5、表3および表4に示されています。 ＭＰＤ ＣＤＲ中の３ ７個の発現配列のうち、２ ０個は骨髄単核細胞中で発現された。 これらのうち、１ ６はまた、ＣＤ３ ４陽性細胞で発現された。 ＭＤＳ／ＡＭＬ ＣＤＲ内では、２ ０個の転写配列のうち１ １個が骨髄単核細胞で発現された。 これらのうち、８つはまた、ＣＤ３ ４陽性細胞で発現された。 MPDとMDS/AML Cdrとの間の重複領域内にある16の転写配列のうち、8つが骨髄細胞で発現され、そのうち5つがCD34陽性細胞でも発現された。 したがって、これらの５つの転写配列は、ＭＰＤおよびＭＤＳ／ＡＭＬ Ｃｄｒの両方内に存在し、造血前駆細胞区画内で発現されるので、主要な候補遺伝子を表す。 それらには、Ｅｓｔｓｈｇｃ−３ ６ ８ ５ ８およびＷＩ−１ ２ ５ １ ５に対応する２つの未知の遺伝子、ならびに３つの遺伝子、ＳＦＲＳ６、ｈ−ｌ（３）ｍｂｔおよびＭＹＢＬ２が含まれる。